第一節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能

PAGEPAGE50第一章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)譯自albuminoid，該詞來自拉丁文albumina（蛋白）。1838年，德國化學(xué)家Mulder建議采用protein一詞，立即得到瑞典著名化學(xué)家Berzelius的支持，逐漸被學(xué)術(shù)界普遍采用，該詞源自希臘文προτο，意為最原始、最基本、最重要的。可見，蛋白質(zhì)自發(fā)現(xiàn)后一直受到化學(xué)家和生物學(xué)家的重視。因為蛋白質(zhì)是活細胞中含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子，是各種生物功能主要的體現(xiàn)者。蛋白質(zhì)是以核酸為模板合成的，是基因表達的主要產(chǎn)物，因此人們將核酸稱為“遺傳大分子”，而把蛋白質(zhì)稱為“功能大分子”。近半個多世紀(jì)以來，以核酸-蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系為中心，逐漸形成了分子生物學(xué)，成為帶領(lǐng)生命科學(xué)進入新時代的龍頭。蛋白質(zhì)是20種天然氨基酸縮合成的大分子，分子量從10kDa至數(shù)百kDa，有著極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。1952年丹麥生物化學(xué)家Linderstrom-Lang提出蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)概念，把蛋白質(zhì)研究納入正軌。越來越多的證據(jù)雄辯地表明，蛋白質(zhì)的功能與其特殊的結(jié)構(gòu)有著十分密切的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)構(gòu)是特定功能的內(nèi)在依據(jù)，功能則是特定結(jié)構(gòu)的外在表現(xiàn)。目前，對于蛋白質(zhì)功能的認識包括以下三個方面：①蛋白質(zhì)對生命活動的貢獻，即其生物學(xué)意義；②蛋白質(zhì)的分子功能，即它參與完成的生化活動；③蛋白質(zhì)的亞細胞定位，即其發(fā)揮功能的位置與環(huán)境。以水通道蛋白（aquaporin）為例，它的四聚體定位于紅細胞、腎細胞等的質(zhì)膜中，形成一個通道，其功能就是允許水分子通過，為維持細胞內(nèi)外滲透壓平衡作出貢獻。因此，闡明蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系是現(xiàn)代生物化學(xué)的基本命題，是揭示生命運動規(guī)律的必由之路，應(yīng)當(dāng)受到所有生命科學(xué)工作者的關(guān)注。隨著這些生物大分子及其復(fù)合物精確三維結(jié)構(gòu)的測定以指數(shù)曲線增長，已累積了相當(dāng)多的有關(guān)數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)之上，十多年來形成了以研究生物大分子及其復(fù)合物和組裝體的三維結(jié)構(gòu)、運動和相互作用，以及它們與生物學(xué)功能和病理現(xiàn)象的關(guān)系為主要內(nèi)容的新興學(xué)科——結(jié)構(gòu)生物學(xué)，把生命科學(xué)推進到新的時代。1.1蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)按結(jié)構(gòu)特點天然蛋白質(zhì)可劃分為：球形蛋白質(zhì)（globularprotein）、纖維狀蛋白質(zhì)（fibrousprotein）、膜蛋白（membraneprotein）和天然無序蛋白質(zhì)（intrinsicallydisorderedprotein），其中，被研究得最早、最多和最深入的當(dāng)屬球形蛋白質(zhì)。1952年，丹麥生物化學(xué)家Linderstrom-Lang把球形蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)劃分為三個不同的組織層次（level,hierarchy）：一級結(jié)構(gòu)（primarystructure）指多肽鏈中氨基酸殘基的數(shù)目、組成及其排列順序（N-端→C-端），即由共價鍵維系的多肽鏈的一維（線性）結(jié)構(gòu)，不涉及空間排列。二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）是多肽鏈主鏈（backbone）在氫鍵等次級鍵作用下折疊成的構(gòu)象單元或局部空間結(jié)構(gòu)，未考慮側(cè)鏈的構(gòu)象和整個肽鏈的空間排布。三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）則指整個肽鏈的氨基酸殘基側(cè)鏈基團互相作用以及與環(huán)境間的相互作用下形成的三維結(jié)構(gòu)。1958年英國晶體學(xué)家Bernal發(fā)現(xiàn)寡聚蛋白由具有三級結(jié)構(gòu)的亞基在次級鍵作用下結(jié)合而成，遂把寡聚體內(nèi)亞基的空間排列稱為四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）。上述蛋白質(zhì)分子一、二、三、四級結(jié)構(gòu)的概念已被國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會命名委員會正式采納和定義。1973年Rossman發(fā)現(xiàn)相鄰的二級結(jié)構(gòu)往往形成某種有規(guī)律的、空間上可辯認的、更高層次的折疊單元，稱為超二級結(jié)構(gòu)（super-secondarystructure）或折疊單元（foldingunit），主要涉及這些構(gòu)象元件在空間上如何聚集。與此同時，Wetlaufer觀察到蛋白質(zhì)分子中存在相對穩(wěn)定的球狀亞結(jié)構(gòu)，其間由單肽鏈相互連接，命名為結(jié)構(gòu)域（structuraldomain）。圖1.1和圖1.2展示蛋白質(zhì)（主要指球狀蛋白）分子結(jié)構(gòu)的不同層次及其相互聯(lián)系。圖1圖1.1蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)層次：A、一級結(jié)構(gòu)，B、二級結(jié)構(gòu)，C、結(jié)構(gòu)域，D、三級結(jié)構(gòu)，E、四級結(jié)構(gòu)，F(xiàn)、大分子子組合體圖1.2球狀蛋白分子結(jié)構(gòu)的不同水平圖中A代表組成一級結(jié)構(gòu)的各種氨基酸；S和sS分別代表蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)和由它們組合成的超二級結(jié)構(gòu)；D/T表示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，如果是單結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，此結(jié)構(gòu)域即蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；同樣，T/α表示由結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)或亞基；Q代表蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)，可以是n個相同亞基α裝配成的同源聚集體，也可以是n個α亞基和m個β亞基（甚至更多種亞基）形成的異源聚集體。1.1.1蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)氨基酸氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。在蛋白質(zhì)生物合成中，mRNA指令20種α-氨基酸依次參入，形成特定的多肽鏈。這20種蛋白質(zhì)氨基酸除Gly外，其α碳原子均屬不對稱碳原子，因而都具有光學(xué)活性，且均為L-型氨基酸。多肽鏈中氨基酸殘基的側(cè)鏈基團（R）各不相同，對多肽鏈的構(gòu)象有很大影響。蛋白質(zhì)氨基酸的一些重要參數(shù)可參看表1.1。表1.1蛋白質(zhì)氨基酸的某些特性氨基酸縮寫符號分子量（Da）體積（?3）可接觸面積（?2）疏水性（K-D法相）總頻率*（%）在內(nèi)部的頻率（%）在外部的頻率（%）轉(zhuǎn)移自由能(kcal·mol-1)Ala71.0888.61151.8(7)8.711.07.90.20Arg(R)156.20173.4225－4.0(20)－1.34Asn(N)114.11117.7160－3.5(15)5.22.06.3－0.69Asp(D)115.05111.1150－3.5(15)－0.72Cys(C)103.13108.51352.5(5)0.67Gln(Q)128.14143.9180－3.5(15)－0.74Glu(E)129.12138.4190－3.5(15)4.91.06.2－1.09Gly(G)57.0660.1750.4(8)9.06His(H)137.15153.2195－3.2(14)0.04Ile(I)113.17166.71754.5(1)4.910.53.00.74Leu(L)113.17166.71703.8(3)6.55Lys(K)128.18168.7200－3.9(19)－2.00Met(M)131.21162.91851.9(6)1.53.00.90.71Phe(F)147.18189.92102.8(4)0.67Pro(P)97.12122.7145－1.6(13)4.02.24.7－0.44Ser(S)87.0889.0115－0.8(10)7.05.08.9－0.34Thr(T)101.11116.1140－0.7(9)－0.26Trp(W)186.21227.8255－0.9(11)0.45Tyr(Y)163.18193.6230－1.3(12)－0.22Val(V)99.14140.01554.2(2)6.61*46種蛋白質(zhì)共5436個殘基中各種氨基酸殘基所占百分比為總頻率；在分子內(nèi)部每種殘基總數(shù)被內(nèi)部殘基總數(shù)（1396）除所得百分比為在內(nèi)部的頻率；在分子表面每種殘基總數(shù)除以表面殘基總數(shù)（4040）得到的百分比為在表面的頻率。根據(jù)側(cè)鏈基團的性質(zhì)，20種蛋白質(zhì)氨基酸可劃分為非極性氨基酸（Ile、Val、Leu、Phe、Ala、Pro、Met、Trp）和極性氨基酸，后者又可分為堿性氨基酸（Arg、Lys、His）、酸性氨基酸（Asp、Glu）和中性氨基酸（Gly、Cys、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln）。一般認為，如果發(fā)生同類氨基酸取代，不會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生明顯影響。但是，如果這種取代發(fā)生在蛋白質(zhì)的關(guān)鍵位點，尤其是許多同類氨基酸的翻譯后修飾有很大區(qū)別，因而很可能出現(xiàn)突出的差異。例如，Lys的ε-氨基與Arg的胍基都帶有正電荷，但前者可被乙酰化、泛素化，后者可被ADPR基化；Tyr的苯環(huán)還可被碘化，羥基可被磷酸化，Phe則不能。對嗜熱微生物的研究表明，它們的蛋白質(zhì)中明顯偏愛一些氨基酸，如堿性氨基酸中的Lys，酸性氨基酸中的Glu，非極性氨基酸中的Ile等。這種選擇性很可能與嗜熱菌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和超強的耐熱性相關(guān)。除上述20種蛋白質(zhì)氨基酸外，近幾年在含硒蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的硒代半胱氨酸（Selenocysteine）實際上是在蛋白質(zhì)合成過程中特殊的Ser-tRNA的修飾產(chǎn)物，識別終止密碼子UAG，參入多肽鏈，在這些含硒蛋白質(zhì)中具有重要的功能。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究進展蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)即多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序（N-端→C-端）是由基因編碼的，是蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，因此一級結(jié)構(gòu)的測定成為十分重要的基礎(chǔ)研究。1945—1955年，英國生物化學(xué)家Sanger率先完成了人胰島素的序列測定。1950年，瑞典科學(xué)家Edman發(fā)明了以他的名字命名的N-端測定法，并與Begg在1967年發(fā)明了序列儀，極大地推動了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定工作。盡管如此，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定仍是一項相當(dāng)耗費時間和資金的工作。因而測序方法和技術(shù)的改進與創(chuàng)新勢在必行。主要進展包括以下幾方面：（1）Edman降解試劑和方法的改進Edman最初使用異硫氰酸苯酯，在許多方面已不能滿足測定需要，因此要求進一步提高Edman降解試劑的專一性，并使降解產(chǎn)物（氨基酸衍生物）易于鑒定和提高檢測靈敏度。如采用4-N，N-二甲基氨基偶氮苯-異硫氰酸酯/異硫氰酸苯酯雙偶合法，可將測定精度提高1~2個數(shù)量級。同位素標(biāo)記的降解試劑可用于10－12mol的肽測序。（2）序列儀的改進與創(chuàng)新早期的液相序列儀樣品和試劑用量大，一次只能連續(xù)測定20~40個殘基。1980年代中期以來，發(fā)展并改良的固相法采用PVDF膜，與待測蛋白的C-端偶聯(lián)，樣品用量減至1~10nmol，一次可連續(xù)測定60個殘基。同時問世的氣相測序儀靈敏度高，樣品用量最少為5pmol，溶劑和試劑消耗為液相序列儀的10%，而且檢測速度快。（3）質(zhì)譜法在蛋白質(zhì)測序中的應(yīng)用質(zhì)譜法特別適用于小肽測序，質(zhì)譜/氣相色譜聯(lián)用儀自動化水平高，數(shù)秒鐘即可完成10個氨基酸的小肽測序。由于把場致解吸附、等離子非吸附、離子噴射、快速電子沖擊等技術(shù)引入質(zhì)譜法，可省去測序中最耗時的分肽程序。（4）核酸測序與蛋白質(zhì)測序有機結(jié)合，相互印證，仍是當(dāng)前的最佳選擇。據(jù)截止1997年底的統(tǒng)計，主要的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫SWISS-PROT已收入69000個蛋白的序列，其中絕大數(shù)是根據(jù)cDNA或DNA序列推測的。圖1.3核糖核酸酶的變性-復(fù)性實驗1.1.2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)圖1.3核糖核酸酶的變性-復(fù)性實驗決定蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的因素（1）肽鏈的折疊模式取決于其特定的氨基酸序列1960年代，C.Anfinsen牛胰RNase變性/復(fù)性實驗證實（圖1.3），多肽鏈中氨基酸序列包含著決定其三維結(jié)構(gòu)的信息，稱為蛋白質(zhì)卷曲密碼（codeofproteinfolding）或立體化學(xué)密碼(stereochemistrycode)，至今尚未完全破譯。（2）細胞內(nèi)特有的微環(huán)境（pH、離子強度、水、溫度等）是多肽鏈折疊成天然構(gòu)象的重要環(huán)境因素。（3）維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力：蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象主要靠二硫鍵和一些弱的相互作用或非共價鍵（次級鍵）來維持，包括氫鍵、鹽鍵、疏水作用和VanderWaals力等，它們的鍵能見表1.2。表1.2蛋白質(zhì)中的二硫鍵和幾種次級鍵的鍵能鍵鍵能a(kJ·mol－1)二硫鍵210鹽鍵12~30氫鍵13~30疏水作用12~20bVanderWaals力4~8a.鍵能指斷裂該鍵所需的自由能。b.此數(shù)值表示25℃肽鍵的性質(zhì)Pauling(1945年)和Momany（1975年）先后測定了肽鍵的基本數(shù)據(jù)，如圖1.4所示。由于反式構(gòu)型中兩個Cα及其取代基團互相遠離，而順式構(gòu)型中它們彼此接近，易發(fā)生空間位阻，反式構(gòu)型比順式構(gòu)型更穩(wěn)定。但脯氨酸殘基吡咯環(huán)δ碳原子在反式構(gòu)型中與鄰近的氨基酸側(cè)鏈發(fā)生空間位阻，因此形成順式構(gòu)型。圖圖1.4肽鍵的基本量綱（A）常見的反式肽鍵；（B）肽鍵的共振；（C）罕見的順式肽鍵圖1.5肽平面與二面角示意圖由于肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，肽鍵兩端有關(guān)原子（羰基C、羰基O、羰基C連接的Cα、氨基N、氨基H和氨基N連接的Cα）必須處于同一平面，稱為肽平面。繞C-Cα單鍵轉(zhuǎn)動的為Ψ角，繞N-Cα單鍵轉(zhuǎn)動的為Φ角，相鄰的肽平面通過Cα彼此連接（圖1.5）。Ψ角以Cα-C對N-H鍵呈反式時為0°，Φ角以N-Cα對C-O鍵呈反式時為0°。從Cα看，Cα-C鍵或N-Cα鍵順時針方向旋轉(zhuǎn)用“+”號表示，沿反時針方向旋轉(zhuǎn)用“－圖1.5肽平面與二面角示意圖分子內(nèi)非鍵合原子間的最小距離已經(jīng)測定，小于這個距離會產(chǎn)生空間位阻，實際上是不允許的。正因為如此，圖1.4（a）的反式肽鍵比（c）的順序肽鍵更加穩(wěn)定。在理論上，Φ和Ψ都是（到+180°）的旋轉(zhuǎn)范圍。由于肽鏈中氨基酸側(cè)鏈基團的大小、形狀和性質(zhì)各異，有的相互吸引或排斥，有的相互作用，從而限制了肽平面間相對旋轉(zhuǎn)的角度，實際允許的二面角只占很少一部分，正如Ramachandran根據(jù)13種蛋白質(zhì)2500個殘基的二面角作出構(gòu)象圖所示（圖1.6）。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)φ圖1.6Rφ圖1.6Ramachandran構(gòu)象圖αR與αL：右手α-螺旋與左手α-螺旋；β：反平行β-折疊；β1：平行β-折疊；C：膠原三股螺旋；310：310-螺旋；π：π-螺旋（4.316-螺旋）（1）螺旋（helix）：多肽鏈主鏈Cα-C-N的重復(fù)排列，使它容易形成有規(guī)律的卷曲構(gòu)型，即形成螺旋。通常用每圈螺旋的殘基數(shù)（s）、氫鍵環(huán)中原子數(shù)（m）和螺旋的手性（R或L）表示不同的螺旋（圖1.7）。①α-螺旋：3.613R，即每圈約3.6個殘基，每個肽鍵N上的H與后面第四個殘基上肽鍵羰基O之間形成氫鍵，其間包括13個原子，右手螺旋，是球蛋白中最常見的結(jié)構(gòu)。r=2.3?，d=1.5?；φ=－57°，ψ=－47°。②310R螺旋：僅見于α-螺旋最末一圈。r=1.9?,d=2.0?;φ=－49°，ψ=－26°。③π-螺旋：4.416R，存在于某些天然蛋白質(zhì)中，如過氧化氫酶等。r=2.8?,d=1.1?。此外在天然蛋白中還發(fā)現(xiàn)γ-螺旋（5.117）、δ-螺旋（4.314L）、膠原螺旋（3.3L）和（2）β-片層（β-pleatedsheet）：兩股或多股幾乎完全伸展的肽鏈并列聚集，靠主鏈肽鍵N上的H與相鄰鏈羰基C上的O原子間規(guī)律的氫鍵，形成β-折疊片。β-折疊片有的是平行的，有的是反平行的（圖1.8）。β-折疊片在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中占有重要地位，如絲蛋白、羽毛蛋白和一些球蛋白含有大量β-折疊片。天然蛋白中的β-折疊片往往是非平面的，具有左手扭曲以便進一步組裝。圖圖1.7α-、310-和π螺旋示意圖圖1.8β-折疊片示意圖（3）回折（reverseturn）：肽鏈要折疊成堅實的球形，必須以某種方式多次改變其方向，如同一肽鏈形成的β-折疊股之間的連接肽。3~4個氨基酸殘基通過特殊的氫鍵系統(tǒng)使肽鏈走向改變180°稱為回折或轉(zhuǎn)角。①β-回折：由4個氨基酸殘基組成，即第一個殘基的羰基O與第四個氨基酸殘基α-氨基上的H之間形成氫鍵，包括Ⅰ型和Ⅱ型，常分布在球蛋白表面，可占其全部殘基的1/3（圖1.9A③γ-回折：由3個氨基酸殘基組成，第一個殘基的羰基O與第三個殘基的α-氨基H原子間形成氫鍵，常出現(xiàn)在反平行β-折疊股之間（圖1.9C）。圖圖1.9β-回折和γ-回折示意圖（A）Ⅰ型β-回折（B）Ⅱ型β-回折，R3總是Gly（C）γ-回折（4）Ω環(huán)（Ωloop）：多肽鏈中由6~16個氨基酸殘基（多于β-回折的殘基數(shù)，少于復(fù)合環(huán)的殘基數(shù)）組成的環(huán)狀節(jié)段，兩端距離小于0.1nm,狀似Ω字形，因此得名。Ω環(huán)形成一個內(nèi)部空腔，被環(huán)上殘基的側(cè)鏈基團包裹，成為致密的球狀構(gòu)象。根據(jù)67種蛋白質(zhì)、11885個殘基的結(jié)構(gòu)分析，處于α-螺旋、β-折疊、β-回折和Ω環(huán)中的殘基分別占26%、19%、26%和21%。Ω環(huán)以親水殘基為主，幾乎總是位于蛋白質(zhì)分子表面，與生物活性有關(guān)。例如，溶菌酶18~25、44~52、60~75的殘基構(gòu)成三個Ω環(huán)，其中的Asn19、Arg21、Arg45、Asp48和Cys-64為其抗原決定簇的組分。（5）連接條帶：伸展的肽鏈條帶（straps）連接在結(jié)構(gòu)元件之間，它們的長度、走向頗不規(guī)則，有的使肽鏈走向改變，有些使肽鏈微微彎曲，可使肽鏈密集，也可出現(xiàn)扭結(jié)，在蛋白質(zhì)肽鏈的卷曲、折疊過程中具有明確的結(jié)構(gòu)作用。主鏈連接條帶與之間一般不形成氫鍵，但常位于蛋白質(zhì)分子表面，多數(shù)是帶電荷或有極性的氨基酸殘基，能與環(huán)境中水分子形成氫鍵。比較不同種屬的同源蛋白質(zhì)氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)連接區(qū)常有氨基酸殘基的取代、插入、消除等變異，說明連接肽段具有易突變的特點。從功能角度看，連接條帶往往參與形成酶的活性部位或蛋白質(zhì)的結(jié)合部位。α-螺旋、β-片層可視為蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的骨架，稱為規(guī)范的或規(guī)正的結(jié)構(gòu)元件，回折、Ω-環(huán)和連接條帶則稱為部分規(guī)正的二級結(jié)構(gòu)，不僅把規(guī)正的結(jié)構(gòu)元件連接成更復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，而且包含了大部分蛋白質(zhì)生物學(xué)活性必需的基團。根據(jù)部分球狀蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計了各種氨基酸殘基出現(xiàn)在α-螺旋、β-片層和β-回折與Ω-環(huán)四類二級結(jié)構(gòu)中的幾率（表1.3）。應(yīng)當(dāng)指出，氨基酸殘基特有的結(jié)構(gòu)與其出現(xiàn)在某種二級結(jié)構(gòu)中的幾率存在著一定的聯(lián)系，例如Pro、Gly、Asn等易形成β-轉(zhuǎn)角，破壞α-螺旋的連續(xù)性。但是，決定二級結(jié)構(gòu)（和其它高級結(jié)構(gòu)）的主要是氨基酸序列，涉及殘基附近其它殘基的近距離相互作用甚至遠距離相互作用。目前根據(jù)同源序列類推和數(shù)學(xué)模型計算，利用氨基酸序列預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的成功率最高可達75%。隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的不斷深入和大型計算機的應(yīng)用，預(yù)測成功率將會大大提高。表1.3氨基酸殘基出現(xiàn)在四種主要構(gòu)象單元中的相對頻率氨基酸α-螺旋β-折疊片β-回折Ω-環(huán)Ala1.290.900.780.90Cys1.110.740.801.16Leu1.301.020.590.75Met1.470.970.390.57Glu1.440.751.000.93Gln1.270.800.970.90His1.221.800.691.01Lys1.230.770.961.02Val0.911.490.470.69Ile0.971.450.510.68Phe1.071.320.580.85Tyr0.721.251.051.06Trp0.991.140.750.90Thr0.821.211.031.00Gly0.560.921.641.35Ser0.820.951.331.41Asp1.040.721.411.29Asn0.900.761.281.48Pro0.520.641.911.33Arg0.960.990.881.00蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)具有某種可變性，例如，pH、溫度、溶劑、配體等環(huán)境因素影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；某些序列相同的片斷在不同蛋白質(zhì)中或呈α-螺旋或為β-折疊，稱為兩可肽。例如，磷酸丙糖異構(gòu)酶112~116VAHAL呈α-螺旋；灰色鏈孢霉蛋白酶25~29同樣的VAHAL卻呈現(xiàn)β-折疊。這是因為在磷酸丙糖異構(gòu)酶中107~111片斷傾向于形成α-螺旋；而在灰色鏈孢酶蛋白酶中20~24片斷傾向于形成β-折疊。1.1.3兩個或多個相鄰的構(gòu)象元件被長度、走向不規(guī)則的連接肽彼此連接，進一步組合成有規(guī)律的、空間上可以辨認的局部折疊，稱為超二級結(jié)構(gòu)，是形成完整三維結(jié)構(gòu)的過度性結(jié)構(gòu)層次。簡單超二級結(jié)構(gòu)：兩個或少數(shù)構(gòu)象單元與連接肽形成簡單的超二級結(jié)構(gòu)，又稱模體（motif）。從240種蛋白質(zhì)的高分辨率結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)四種頻繁出現(xiàn)的簡單超二級結(jié)構(gòu)。（1）α-拐角（α-αcorner）：兩個α-螺旋經(jīng)連接肽轉(zhuǎn)90°的彎（圖1.10A,B（2）α-發(fā)夾（α-hairpin）：兩個α-螺旋經(jīng)連接肽轉(zhuǎn)180°（圖1.10C,D）。（3）β-發(fā)夾（β-hairpin）：兩個等長、反平行的β-折疊股被連接肽連接，兩股之間形成1~6個氫鍵（圖1.10F,G,H,I,J）。（4）拱形結(jié)構(gòu)（arch）：兩個不在同一平面的構(gòu)象元件經(jīng)連接肽連接而成，如一個α-螺旋與一個扭曲的β-折疊股形成的拱形結(jié)構(gòu)（圖1.10E,K）。圖1圖1.1011種比較頻繁發(fā)生的超二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的超二級結(jié)構(gòu)：多個構(gòu)象元件或簡單超二級結(jié)構(gòu)可進一步組合成復(fù)雜的超二級結(jié)構(gòu)。圖1.11復(fù)繞α-螺旋A復(fù)繞α-螺旋形成左手超螺旋B兩個平行的α-螺旋的圓柱形C兩螺旋間界面的疏水相互作用（1）復(fù)繞α-螺旋（coiled-coilα-helix）:圖1.11復(fù)繞α-螺旋A復(fù)繞α-螺旋形成左手超螺旋B兩個平行的α-螺旋的圓柱形C兩螺旋間界面的疏水相互作用圖1.12βχβ單元的手性：A右手型B左手型圖1.13Rossmann折疊（2）βχβ-單元（βχβ-unit）：兩條平行的β-折疊股由一個χ結(jié)構(gòu)連接，如χ為α-螺旋則為βαβ單元；如χ為β-折疊股則為βββ單元；如χ為無規(guī)卷曲則為βcβ單元。βχβ單元有右手型和左手型（圖1.12圖1.12βχβ單元的手性：A右手型B左手型圖1.13Rossmann折疊（3）β-迂回（β-meander）：三條或三條以上反平行β-折疊股由短鏈相連，可形成多種不同形式的結(jié)構(gòu)（圖1.14）。圖1.15β-折疊筒A反平行式β-折疊筒B展開的各種β-折疊筒ABC圖1.14β-迂回A簡單的β-迂回；B希臘鑰匙；C雙希臘鑰匙（4）β圖1.15β-折疊筒A反平行式β-折疊筒B展開的各種β-折疊筒ABC圖1.14β-迂回A簡單的β-迂回；B希臘鑰匙；C雙希臘鑰匙一些已知功能的超二級結(jié)構(gòu)有些超二級結(jié)構(gòu)與某種功能相關(guān)，成為研究結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系的熱點和從頭設(shè)計蛋白質(zhì)的重點，如下面介紹的一些與DNA相互作用的蛋白因子和鈣結(jié)合蛋白特有的模體。圖1.16螺旋-回折-螺旋模體（A）HTH的結(jié)構(gòu)，兩個α-螺旋用圓柱體表示，小圓圈表示氨基酸殘基，羧基端的α-螺旋為識別螺旋；（B）識別螺旋嵌入DNA主槽，識別特定的堿基序列信息。（1）螺旋-回折-螺旋（helix-turn-helix,HTH）：最先發(fā)現(xiàn)于λ噬菌體cro阻遏蛋白（B.Matthews等，1983），由兩個α-螺旋通過一個β-回折連接而成，含有66個氨基酸殘基。HTH羧基端螺旋可嵌入DNA雙螺旋主槽中，螺旋暴露的氨基酸側(cè)鏈基團與主槽中暴露的堿基之間形成專一的氫鍵（圖1.16）。其它調(diào)控蛋白，如圖1.16螺旋-回折-螺旋模體（A）HTH的結(jié)構(gòu)，兩個α-螺旋用圓柱體表示，小圓圈表示氨基酸殘基，羧基端的α-螺旋為識別螺旋；（B）識別螺旋嵌入DNA主槽，識別特定的堿基序列信息。（2）鋅指（Zinefinger,ZF）:1983年Hamas發(fā)現(xiàn)爪蟾TF-ⅢA與DNA結(jié)合部含Zn2+,稍后Miller和Berg提出并完善鋅指結(jié)構(gòu)的概念。在不同蛋白中ZF模體含14~48個氨基酸不等，通常約含有30個殘基，其線性序列可概括為：-Xn–C(H)–X2-4–C(H)-X4-20–C(H)-X2-4-C(H)–Xn。Zn2+與其中的兩個半胱氨酸（C）和兩個組氨酸（H）殘基的四個配位原子以四面體方式配位，中間的X4-20形成指圖1.17鋅指結(jié)構(gòu)模體A一個鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸序列示意圖；圖1.17鋅指結(jié)構(gòu)模體A一個鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸序列示意圖；B小鼠轉(zhuǎn)錄因子含有3個鋅指結(jié)構(gòu)，識別特定的堿基序列。圖中黑色小球代表Zn2+.含鋅指結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)蛋白很多，包括轉(zhuǎn)錄因子類（如酵母ADP1、GAL4，爪蟾TFIIIA哺乳動物SP1等）；“gag”類基因產(chǎn)物（如果蠅Xfin）；核酸結(jié)合蛋白（如腺病毒ELA蛋白）；甾類激素受體（如糖皮質(zhì)激素受體、鹽皮質(zhì)激素受、孕酮受體、雌激素受體、VD3受體等）；修復(fù)蛋白（如E.coliuvr蛋白、哺乳動物poly[ADP-核糖]聚合酶等）；原癌基因產(chǎn)物（如人V-eabA、C-erbA）和性決定因子（如人ZFY、ZFX）。繼鋅指之后又發(fā)現(xiàn)一些含鋅的模體，統(tǒng)稱為鋅指類結(jié)構(gòu)，包括：鋅簇（Zinecluster,ZC）：約60個氨基酸，其中保守序列為-CX2-CX6-CX6-CX2-CX6C-，6個保守的半胱氨基酸殘基與兩個Zn2+配位形成鋅簇核心，其中兩個Cys同時與兩個Zn2+配位，兩個Zn2+相距約0.35nm。含鋅簇的蛋白質(zhì)有轉(zhuǎn)錄因子GAL4、LAC9A、PPR1、PPR1A、QUTA等。鋅紐（Zinetwist,ZT）:最初發(fā)現(xiàn)于哺乳動物甾類激素受體（如GR、MR、PR、AR等）直接與DNA作用的區(qū)段（40~60個氨基酸），其中-CX2C-X7-H-X5-CX2C-X11-H-X3C-X5-C-X9-CX2C-包含8個相同的Cys殘基，與兩個Zn2+分別形成兩個四面體配位結(jié)構(gòu)，二者之間被15個左右的氨基酸殘基形成的紐隔開，兩個鋅帶（Zincribbon,ZR）：最初發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄因子ⅡS等，包括三條反平行β-折疊股，其中的保守序列-CX2C-X24-CX2C-的4個Cys殘基與一個Zn（3）亮氨酸拉鏈（LeucineZipper,LZ）：1988年，Landschalz在細胞色素c基因調(diào)節(jié)蛋白（Cytc3）、原癌基因myc、v-jun、v-fos的產(chǎn)物和CCAATbox結(jié)合蛋白（CBP）中發(fā)現(xiàn)了亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。LZ結(jié)構(gòu)的C-端為螺旋區(qū)，靠近N-端一側(cè)的一段螺旋富含堿性殘基，其后的一段螺旋每隔6個殘基就有1個Leu，每個這樣的螺旋不少于4個Leu，且都處于螺旋同一側(cè)。這樣，當(dāng)含LZ的蛋白形成同源或異源二聚體時，LZ結(jié)構(gòu)中的Leu殘基借助于疏水作用彼此靠攏，形同拉鏈（圖1.18）。圖1.19螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)示意圖HLH蛋白二聚體中每個單元中兩個α螺旋由環(huán)連接，α螺旋結(jié)合特定的DNA序列（A）圖1.18亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)示意圖A亮氨酸拉鏈二聚體模式圖，L代表Leu殘基，帶黑點的框代表與DNA結(jié)合的堿性螺旋。B亮氨酸拉鏈二聚體結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合，形成倒Y字形，兩個與DNA結(jié)合的單螺旋識別主槽內(nèi)特定的堿基序列。（4）螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix,HLH）：HLH結(jié)構(gòu)是圖1.19螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)示意圖HLH蛋白二聚體中每個單元中兩個α螺旋由環(huán)連接，α螺旋結(jié)合特定的DNA序列（A）圖1.18亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)示意圖A亮氨酸拉鏈二聚體模式圖，L代表Leu殘基，帶黑點的框代表與DNA結(jié)合的堿性螺旋。B亮氨酸拉鏈二聚體結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合，形成倒Y字形，兩個與DNA結(jié)合的單螺旋識別主槽內(nèi)特定的堿基序列。圖1.20小清蛋白的EF手形結(jié)構(gòu)（圖1.20小清蛋白的EF手形結(jié)構(gòu)1.1.4結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域的概念：最初在觀察一些球蛋白的X-射線晶體衍射得到的三維結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)在分子內(nèi)存在緊密的球狀亞結(jié)構(gòu)，稱為結(jié)構(gòu)域?，F(xiàn)在，結(jié)構(gòu)域的概念具有三種不同而又相互聯(lián)系的涵義：即獨立的結(jié)構(gòu)單位、獨立的功能單位和獨立的折疊單位。作為獨立的結(jié)構(gòu)單位，結(jié)構(gòu)域具有內(nèi)在的穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)域之間通過柔性肽鏈相互連接，構(gòu)成所謂組件排列（modularmodel）。多數(shù)蛋白質(zhì)分子包含多個結(jié)構(gòu)域，每個約由100~250個氨基酸組成，其大小相當(dāng)于直徑約2.5nm的小球。一個蛋白質(zhì)分子可以由結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域組成，如彈性蛋白酶包含兩個相似的結(jié)構(gòu)域（圖1.21）；有的則由不同的結(jié)構(gòu)域組成，如木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)域1的構(gòu)象單元主要是α-螺旋，而結(jié)構(gòu)域2主要含反平行β-折疊股（圖1.22）。木瓜蛋白酶堿1木瓜蛋白酶堿2圖1.21彈性蛋白酶結(jié)構(gòu)示意圖圖1.22木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)示意圖結(jié)構(gòu)域作為功能單位表現(xiàn)在不同的結(jié)構(gòu)域具有特定的功能，如底物結(jié)合、催化反應(yīng)、亞基間相互作用和活性調(diào)節(jié)等。目前已知的200多種脫氫酶的結(jié)構(gòu)分析表明，它們均由兩個結(jié)構(gòu)域形成所謂“剛體絞鏈”式結(jié)構(gòu)，一個結(jié)構(gòu)域結(jié)合輔酶，另一個為催化結(jié)構(gòu)域。有些功能域則位于結(jié)構(gòu)域之間的裂隙中，如胰凝乳蛋白酶活性中心的His57、Asp102位于結(jié)構(gòu)域1，活性中心Ser195和底物結(jié)合部位則位于結(jié)構(gòu)域2。結(jié)構(gòu)域作為獨立的結(jié)構(gòu)功能單位的極端情況是多功能酶，如E.coliDNA聚合酶Ⅰ從N-端到C-端依次形成3個結(jié)構(gòu)域，分別具有5′→3′外切酶活性、3′→木瓜蛋白酶堿1木瓜蛋白酶堿2圖1.21彈性蛋白酶結(jié)構(gòu)示意圖圖1.22木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)示意圖前人假設(shè)，結(jié)構(gòu)域既然是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能單位，就應(yīng)當(dāng)與基因中的外顯子相對應(yīng)。其實，認為外顯子編碼完整的結(jié)構(gòu)域?qū)崒僬`解，多數(shù)結(jié)構(gòu)域的編碼序列被內(nèi)含子分隔。不過，內(nèi)含子的存在有利于以結(jié)構(gòu)域為單位的元件重組（moduleshuffing），推進了分子進化。對蛋白質(zhì)卷曲過程的研究以及有限水解的蛋白片段在體外的變性/復(fù)性實驗證明，多肽鏈折疊時，每個結(jié)構(gòu)域都是獨立地、分別地進行折疊，形成不同的結(jié)構(gòu)域，然后再靠攏形成具有天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。因此，結(jié)構(gòu)域是獨立的折疊單位。結(jié)構(gòu)域的運動：結(jié)構(gòu)域本身都是緊密裝配的，結(jié)構(gòu)域之間通過松散的肽鏈形成牢固而又柔韌的連接，為域間較大幅度的相對運動提供了可能，這種結(jié)構(gòu)調(diào)整與其整體功能的行使密切相關(guān)。對馬肝乳酸脫氫酶（LDH）的X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析表明，去輔基LDH與NAD+結(jié)合后發(fā)生顯著的構(gòu)象變化：域間相對運動使之從去輔基LDH的封閉形式轉(zhuǎn)換為LDH全酶的開放形式，有利于底物進入活性部位。結(jié)構(gòu)域的分類：按照結(jié)構(gòu)域中二級結(jié)構(gòu)單元的種類、數(shù)量及其排布，可將結(jié)構(gòu)域粗略的劃分成5類：（1）α-螺旋域：所含構(gòu)象元件主要是α-螺旋，例如蚯蚓血紅蛋白（圖1.23A）。（2）β-折疊域：主要由β-折疊股構(gòu)成，例如lgGVL結(jié)構(gòu)域（圖1.23B）。（3）α+β域：由α-螺旋與β-折疊股不規(guī)則堆積而成，如3-磷酸甘油醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域2（圖1.23C）。（4）α/β域：中央為β-折疊片，周圍是α-螺旋，α-螺旋與β-折疊股交替排布，如丙酮酸激酶結(jié)構(gòu)域1和磷酸甘油酸激酶結(jié)構(gòu)域2（圖1.23D,E）.（5）無α-螺旋和β-折疊股域：沒有或只有少量α-螺旋和β-折疊股，如麥胚凝集素就沒有α-螺旋，只有12%的殘基形成β-折疊股（圖1.23F圖圖1.23五種不同類型的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域的組合在較復(fù)雜的蛋白分子中，結(jié)構(gòu)域的組合主要有以下三種類型：（1）由序列和結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域組合而成。如免疫球蛋白G，兩條重鏈和兩條輕鏈以二硫鏈相連，共含有12相似的全β結(jié)構(gòu)域（圖1.1c和1.23b）。編碼這類蛋白質(zhì)的基因可能是同一始祖基因在分子進化中復(fù)制后串聯(lián)而成。（2）由兩種不同的結(jié)構(gòu)域組合面成。如木瓜蛋白酶C端為全α結(jié)構(gòu)域，N端為全β結(jié)構(gòu)域（圖1.22）；嗜熱菌蛋白酶和T4噬菌體溶菌酶C端為全α結(jié)構(gòu)域，N端為α+β結(jié)構(gòu)域；醇脫氫酶N端為全α結(jié)構(gòu)域，C端為α/β結(jié)構(gòu)域；谷胱甘肽還原酶N端和中間兩個結(jié)構(gòu)域均為α/β型，C端為全β結(jié)構(gòu)域；酪氨酸t(yī)RNA合成酶的N端和C端各有一個全α結(jié)構(gòu)域，中間為α/β結(jié)構(gòu)域。這類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因可能是兩個不同的始祖基因在分子進化中融合的產(chǎn)物。（3）多結(jié)構(gòu)域蛋白由兩種以上多個結(jié)構(gòu)域鑲嵌而成。圖1.24出示幾種多結(jié)構(gòu)域鑲嵌蛋白。這類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因可視為不同基因外顯子重新組合的結(jié)果。圖1.24一些鑲嵌蛋白的結(jié)構(gòu)域組成cyto:胞液內(nèi)肽段；ms：穿越質(zhì)膜的肽段；ccoils：螺旋的螺旋；SRC：巨噬細胞清除劑受體；VWA：vonWillebrand因子的A類重復(fù)肽段；—pppp—：富含脯氨酸肽段；Fn1，F(xiàn)n2，F(xiàn)n3：分別為纖粘蛋白Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ三類重復(fù)肽段；Kuntiz：大豆Kunitz抑制劑特有的結(jié)構(gòu)域；TS和TSN：分別為血小板結(jié)合蛋白Ⅰ類重復(fù)肽段和N端結(jié)構(gòu)域；CTD：膠原C端結(jié)構(gòu)域；（AE）：兩可外顯子；LTD：低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域；MPI：金屬蛋白酶抑劑結(jié)構(gòu)域；CUB：補體亞組分結(jié)構(gòu)域；EGF：表皮生長因子；CCM：補體控制域；F1：因子1隱性蛋白酶（factor1crypticprotease）1.1.5球形蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)多肽鏈在手性效應(yīng)的驅(qū)動下，遵循盡量減小表面的原則，折疊、卷曲形成二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域等局部三維結(jié)構(gòu)。為了獲得整體上能量較低的天然構(gòu)象，這些局部三維結(jié)構(gòu)還需進一步調(diào)整，形成三級結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)反映了蛋白質(zhì)分子或亞基內(nèi)所有原子的空間排布，但不涉及亞基間或分子間的空間排列關(guān)系。球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的特征截止1998年4月，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）發(fā)布的蛋白質(zhì)原子坐標(biāo)已達6617個，這個數(shù)量還以幾何級數(shù)迅速增加。盡管每種球狀蛋白都有其獨特的三維結(jié)構(gòu)，但它們中間仍有某些共同的特征。（1）球狀蛋白質(zhì)分子含有多種二級結(jié)構(gòu)元件以溶菌酶為例，它的分子中含有α-螺旋、β-片層、β-回折和無規(guī)卷曲等（圖1.25）。不同的球狀蛋白質(zhì)中各種元件含量不同（表1.4）。表1.4幾種蛋白質(zhì)中α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量蛋白質(zhì)（殘基總數(shù)）結(jié)構(gòu)元件（殘基百分比）*α-螺旋β-折疊β-回折肌紅蛋白（153）78016溶菌酶（129）401219核糖核酸酶A（124）2635—牛Cu·Zn·SOD亞基（151）144717胰凝乳蛋白酶（247）144528羧肽酶A（307）381717*其余部分為無規(guī)卷曲等。圖1.25溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)（2）球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)具有明顯的折疊層次如前所述（圖圖1.25溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)（3）球狀蛋白質(zhì)分子是緊密的球狀或橢球狀實體蛋白質(zhì)氨基酸組成的VanderWaals體積總和（組成原子依VanderWaals作用范圍所占的總體積）除以蛋白質(zhì)所占體積即得裝配密度，一般為0.72~0.77。這表明即使緊密裝配，蛋白質(zhì)總體積約有25%并未被蛋白質(zhì)原子占據(jù)。這個空間幾乎全為很小的空腔，偶爾有水分子大小或更大的空腔存在。值得注意的是鄰近活性部位的區(qū)域密度比平均值低得多，這可能意味著活性部位有較大的空間可塑性，允許其中的結(jié)合基團和催化基團有較大的活動范圍。這大概就是功能蛋白與其配體相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。（4）球狀蛋白質(zhì)具有疏水的內(nèi)核和親水的表面蛋白質(zhì)折疊形成三級結(jié)構(gòu)的驅(qū)動力是形成可能的最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。首先，肽鏈必須滿足自身結(jié)構(gòu)固有的限制，包括手性效應(yīng)和α-碳二面角在折疊上的限制；其次，肽鏈在熵因素驅(qū)動下必須盡可能地埋藏疏水側(cè)鏈，使之與溶劑水的接觸降到最小程度，同時讓親水側(cè)鏈暴露在分子表面，與環(huán)境中水分子形成廣泛的氫鍵連系。疏水的內(nèi)核幾乎全部由β-折疊片和α-螺旋組成，β-回折、Ω環(huán)和連接條帶多位于分子表面。雖然多肽鏈主鏈?zhǔn)菢O性的，但由于α-螺旋和β-折疊片有很好的氫鍵網(wǎng)，有效地中和了主鏈的極性，使之穩(wěn)定地處于疏水核心區(qū)。球狀蛋白質(zhì)中，多數(shù)α-螺旋具有兩親性（amphipathy），主要由極性和帶電殘基組成的一面向外暴露于溶劑；富含疏水殘基的一面向內(nèi)。平行β-折疊片一般存在于疏水內(nèi)核；反平行β折疊片疏水一側(cè)向內(nèi)，親水一側(cè)與溶劑接觸。（5）球狀蛋白質(zhì)分子表面有一空穴球狀蛋白質(zhì)分子表面有一個分布著許多疏水殘基的空穴或裂隙，常是結(jié)合底物、效應(yīng)物等配體并行使生物學(xué)功能的活性部位，這樣的空穴為發(fā)生化學(xué)反應(yīng)營造了一個低介電區(qū)域。球狀蛋白質(zhì)的分類根據(jù)結(jié)構(gòu)域的特點，Richardson于1982年把球狀蛋白質(zhì)分為4大類：全α-結(jié)構(gòu)、α/β-結(jié)構(gòu)、全β-結(jié)構(gòu)和小的富含金屬或二硫鍵的結(jié)構(gòu)。除少數(shù)混合型結(jié)構(gòu)之外，大多數(shù)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)都歸入這4種類型之一。每種結(jié)構(gòu)類型包括若干折疊模式或折疊子（flods）。折疊子包括蛋白質(zhì)核心結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)元件及其相對排布位置和肽鏈走向，是對蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)分類的基礎(chǔ)。據(jù)估計，自然界存在的折疊子不足1000種。具有同一種折疊子的蛋白質(zhì)構(gòu)成一個超家族，多數(shù)折疊子只含一個蛋白質(zhì)超家族，少數(shù)含2-4個超家族，個別折疊子含多個超家族。按照序列同源性＞30%或者結(jié)構(gòu)-功能相近，每個超家族又劃分成數(shù)目不等的蛋白質(zhì)家族，大多數(shù)的超家族只有一個家族，少數(shù)包括2-4個家族，只有很少的蛋白質(zhì)超家族含多個家族。這樣，就形成了一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類型→折疊子→蛋白質(zhì)超家族→蛋白質(zhì)家族→蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的樹狀結(jié)構(gòu)層次。有關(guān)信息可根據(jù)需要在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類（SCOP）數(shù)據(jù)庫（http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop）查找。圖1.26反平行α螺旋結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)A．四螺旋束結(jié)構(gòu)示意圖；B．蚯蚓血紅蛋白；C．煙草花葉病毒外殼蛋白（亞基）（1）全α-結(jié)構(gòu)（反平行α-螺旋）蛋白質(zhì)此類結(jié)構(gòu)中α圖1.26反平行α螺旋結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)A．四螺旋束結(jié)構(gòu)示意圖；B．蚯蚓血紅蛋白；C．煙草花葉病毒外殼蛋白（亞基）全α-結(jié)構(gòu)的另一亞類相鄰的兩個螺旋采取接近相互垂直的取向，整個多肽鏈折疊成兩層，交叉堆積，如去輔基肌紅蛋白和血紅蛋白（見圖1.35和圖1.39）。（2）α/β-結(jié)構(gòu)（平行或混合型β-折疊股）蛋白質(zhì)此類結(jié)構(gòu)以平行或混合型（含平行和反平行β-折疊股）β-折疊片為基礎(chǔ)，分為兩個亞類：單繞平行β-桶和雙繞平行β-片或馬鞍形扭曲片。單繞平行β-桶由8個平行的β-折疊股按Rossman折疊單向卷曲環(huán)形排列，第1與第8兩股之間借氫鍵形成閉合圓筒，是一種高度對稱的結(jié)構(gòu)。作為右手交叉連接的7個α-螺旋和C-端螺旋都在圓筒外側(cè)，形成了一個與內(nèi)桶同軸平行的外桶。兩個桶都是右手扭曲，緊挨在一起，在二者之間是一個疏水夾層。中央空間只能容納β-折疊片內(nèi)側(cè)的疏水側(cè)鏈，構(gòu)成此類分子的疏水核心。連接α-螺旋和β-折疊股的回環(huán)區(qū)上有關(guān)殘基構(gòu)成活性中心，如磷酸丙糖異構(gòu)酶（圖1.27A圖1.27平行β-折疊片結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶（側(cè)面）磷酸丙糖異構(gòu)酶（頂面）BA雙繞平行β-片如乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域1（圖1.27B），中間由4~9個平行的β-折疊股或混合型β-折疊股構(gòu)成馬鞍形扭曲片，β-片的兩側(cè)為α-螺旋和環(huán)狀區(qū)段。這種結(jié)構(gòu)可看成肽鏈從β-折疊片的中部開始沿相反的兩個方向向外卷繞，即按一個方向卷繞形成Rossman折疊，α圖1.27平行β-折疊片結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶（側(cè)面）磷酸丙糖異構(gòu)酶（頂面）BA（3）全β-結(jié)構(gòu)（反平行β-折疊片）蛋白質(zhì)主要由反平行β-折疊片排列形成，β-股之間以β-回折或跳過相鄰β-股的條帶相連。最常見的一類是希臘鑰匙β-桶，如Cu-Zn-SOD亞基（圖1.28A），它的β-股呈反時針方向盤繞，桶的相對兩邊β另一類型稱為上下型β-桶，相鄰的β-股一上一下反平行排列，通過長短不一的β-發(fā)夾連接，其配體結(jié)合部位在桶的疏水內(nèi)部，如視黃醇結(jié)合蛋白（圖1.28B）。由3~15個β-股形成的單層反平行β-折疊片稱為露面夾心（open-facesandwich）結(jié)構(gòu)，其一側(cè)可有一層α-螺旋和回環(huán)，片層另一側(cè)暴露于溶劑，如細菌葉綠素蛋白（圖11.2圖1.28反平行β-折疊片結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)圖1.28反平行β-折疊片結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)C細菌葉綠素蛋白圖1.29富含二硫鍵蛋白質(zhì)（A）和富含金屬蛋白質(zhì)（B）的實例1.1.6球狀蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)分子量較大的球狀蛋白質(zhì)多由兩條或多條肽鏈組成，每條肽鏈具有自己的三級結(jié)構(gòu)，稱為亞基（subunit），由彼此間的次級鍵組裝成聚集體，稱為寡聚蛋白（Oligomerprotein）。由幾十個甚至上千個亞基組裝而成的蛋白質(zhì)稱多聚蛋白（polymerprotein）。這些蛋白質(zhì)中亞基的種類、數(shù)目、空間排布及其間的相互作用就是四級結(jié)構(gòu)，在這里不考慮亞基本身的構(gòu)象。由相同的亞基組成的寡聚蛋稱為同源寡聚體（homologousoligomer），含不同亞基的寡聚蛋白稱為異源寡聚體（heterologousoligomer）。自然界寡聚蛋白分子內(nèi)亞基數(shù)多為偶數(shù)。除亞基外，文獻中類似的名稱還有原體（protomer）和單體(monomer)。在許多情況下原體、單體與亞基含義相同，均指寡聚蛋白中一條多肽鏈形成的結(jié)構(gòu)單位。原體有時指異種亞基締合成的寡聚體解聚后最小的結(jié)構(gòu)與功能單位，如血紅蛋白解聚成兩個原體。單體通常指大分子復(fù)合物中的重復(fù)單位；有時指只有一條多肽鏈的蛋白質(zhì)。四級結(jié)構(gòu)的形式具有以下優(yōu)越性：（1）四級結(jié)構(gòu)賦予蛋白質(zhì)更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，以便執(zhí)行更為復(fù)雜的功能。例如除功能簡單的水解酶外，大多數(shù)酶均為寡聚體。（2）通過亞基間的協(xié)同效應(yīng)，可以對酶活性進行別構(gòu)調(diào)節(jié)（詳見酶學(xué)專題）。（3）中間代謝途徑中有關(guān)的酶分子以亞基的形式組裝成結(jié)構(gòu)化多酶復(fù)合物，可避免中間產(chǎn)物的浪費，提高了催化效率。例如E.coli丙酮酸脫氫酶復(fù)合物由丙酮酸脫羧酶、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和二氫硫辛酸脫氫酶各24個、24個和12個拷貝組成，依次催化丙酮酸的脫羧、轉(zhuǎn)乙?；兔摎浞磻?yīng)。（4）可將大小、種類有限的亞基組裝成具有特殊幾何形狀的超分子復(fù)合物，如微管是數(shù)百個αβ微管蛋白二聚體螺旋盤繞，聚集成每周有13個二聚體的微管。（5）寡聚體的形成在一定程度上降低了細胞內(nèi)滲透壓。（6）節(jié)約遺傳信息，減少生物合成中的誤差造成的浪費。如一個蛋白質(zhì)由6000個氨基酸組成，包括6個A順序（700個氨基酸）和6個B順序（300個氨基酸），每次操作的誤差幾率為10－8，若氨基酸序列正確多肽鏈的折疊也正確無誤，剔除錯誤原體的效率為100%。顯然，如果A和B分別編碼然后組裝，所需編碼信息僅為全部從頭編碼的六分之一。從頭合成的總誤差率為6×10－5，而由6個原體（AB）組裝，因為已將有缺陷的原體剔除，組裝過程只需5次操作，其誤差率僅為5×10－8。寡聚蛋白含有較多的疏水氨基酸，不能將其全部埋藏在亞基內(nèi)部，以致在表面還留有不少疏水殘基。為了盡量減少疏水殘基與水的接觸，亞基彼此締合，把疏水殘基藏在亞基接觸面，寡聚體親水的表面與周圍水分子形成氫鍵，使整個分子處于能量最低的狀態(tài)。據(jù)統(tǒng)計，亞基接觸面疏水氨基酸占60%以上，因此疏水作用在啟動亞基締合、形成四級結(jié)構(gòu)上具有十分重要的作用。圖圖1.30亞基排布方式纖維狀蛋白質(zhì)外形呈纖維或細棒狀，這種規(guī)則的線性結(jié)構(gòu)與其肽鏈特有的氨基酸序列形成規(guī)律的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。纖維狀蛋白質(zhì)構(gòu)成動物體的基本支架和外保護成分，占脊椎動物體蛋白總量的一半或更多。纖維狀蛋白質(zhì)可分為兩類：不溶于水的，如角蛋白、膠原蛋白、絲心蛋白等；可溶于水的，如肌球蛋白、血纖維蛋白原等。αα-角蛋白（keratin）是毛發(fā)、指甲等結(jié)構(gòu)中主要的蛋白質(zhì)，其多肽鏈中部約311~314個殘基呈α-螺旋，兩側(cè)為較小的非螺旋區(qū)。毛發(fā)α-角蛋白中，三股右手α-螺旋向左緾繞，擰成一根稱為原纖維（microfibril）的結(jié)構(gòu)元件（圖1.31）。原纖維之間可以形成二硫鍵交聯(lián)，交聯(lián)程度越高纖維越堅牢。羊毛中二硫鍵很少，因而柔軟而富于伸縮性；而指甲及鳥喙中的角蛋白二硫鍵很多，因此特別堅固且不能伸展。絲心蛋白（fibroin）是蠶絲和蜘蛛絲中主要的蛋白質(zhì)，其中大片的反平行β-折疊以平行的方式堆積成多層結(jié)構(gòu)。鏈間主要以氫鍵連接，層間主要靠VanderWaals力維系。絲心蛋白多肽鏈很多區(qū)段為下列重復(fù)排列：[Gly-Ala-Gly-Ala-GlySer-Gly-Ala-Ala-Gly(Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly)8]?？梢娬麄€氨基酸序列中幾乎每隔一個殘基就是甘氨酸，意味著甘氨基酸將全部位于β-折疊片的同一側(cè)，而絲氨酸及丙氨酸殘基位于片層另一側(cè)，從而使交替疊成的β-折疊片層之間分別為甘氨酸殘基聚集區(qū)和丙氨酸（絲氨酸）殘基聚集區(qū)，片層間的距離分別為0.35nm和0.57nm（圖1.32）。由于這種結(jié)構(gòu)方式中絲心蛋白多肽鏈已處于相當(dāng)伸展的狀態(tài)，片層內(nèi)相鄰肽鏈之間有許多氫鍵，以及片層之間由VanderWaals力維系，所以絲很柔軟，有很高的抗張強度卻不能拉伸。圖1.3圖1.32絲心蛋白的結(jié)構(gòu)A．堆積的β-折疊片結(jié)構(gòu)原子模型；B.片層堆積方式示意圖實際上絲心蛋白中尚含有少量纈氨酸、酪氨酸等側(cè)鏈較大的殘基，由它們構(gòu)成無規(guī)則的非晶狀區(qū)。分子中有序的晶狀區(qū)與無序的非晶狀區(qū)交替出現(xiàn)，賦予絲纖維一定的伸展度。圖1.33膠原蛋白結(jié)構(gòu)示意圖1.1.圖1.33膠原蛋白結(jié)構(gòu)示意圖膠原(collagen)是動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占人體蛋白質(zhì)總量的30%以上，遍布于各種組織器官，是胞外基質(zhì)中的框架結(jié)構(gòu)。迄今已發(fā)現(xiàn)19種不同類型的膠原，是不同結(jié)構(gòu)基因編碼的，具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和不同的免疫學(xué)特性。各種類型的膠原分子基本的結(jié)構(gòu)單位都是由3條肽鏈構(gòu)成的3股螺旋結(jié)構(gòu)。以Ⅰ型膠原為例，由3條α1（Ⅰ）鏈或2條α1（Ⅰ）與1條α2（Ⅰ）鏈構(gòu)成。每條α鏈含1056個氨基酸殘基，96%由重復(fù)的Gly-X-Y序列組成，X主要為Pro，Y代表任一氨基酸，常為羥脯氨酸（Hyp）。Pro+Hyp可高達20~25%。特殊的氨基酸序列使膠原單肽鏈呈左手螺旋，每旋轉(zhuǎn)一圈3.3個氨基酸殘基，螺旋半徑0.16nm，螺距0.95nm。三股這樣的螺旋再相互盤繞成右手超螺旋，螺距9.6nm，即超螺旋每轉(zhuǎn)一圈，每條單鏈要經(jīng)歷10個膠原螺旋。三鏈超螺旋中心的空間很小，除Gly外容納不下任何其它氨基酸，故三鏈排列緊密（圖1.33）。新生的膠原肽鏈稱為前α鏈，兩端各具有一段不含重復(fù)序列的前肽。3條前α鏈借助于C-端前肽鏈間二硫鍵“對齊”排列，形成三鏈超螺旋結(jié)構(gòu)，稱為前膠原（procollagen）。在形成前膠原之前要對Pro和Lys殘基進行必要的羥基化修飾，部分Hy1殘基還要糖基化。羥基化的氨基酸有助于鏈間氫鍵的形成，穩(wěn)定三鏈超螺旋。催化羥基化反應(yīng)的是膜結(jié)合的酶，維生素C是脯氨酰羥化酶必需的輔因子。完成翻譯后修飾的前膠原在Golgi器中被包裝進分泌小泡運到細胞外。然后由細胞外兩種特異蛋白酶分別切除N-端和C-端前肽而成為原膠原（tropocollagen）。原膠原錯位階梯式排列，并發(fā)生鏈間側(cè)向共價交聯(lián)，聚合成直徑50~200nm、長150nm至數(shù)μm的原纖維。膠原原纖維中側(cè)向相鄰的Lys和Hyl殘基氧化后產(chǎn)生的兩個醛基可縮合產(chǎn)生醛醇交聯(lián)。一個原膠原N-端與相鄰原膠原C-端之間也可形成交聯(lián)。原膠原交聯(lián)后不溶于水，且具有抗張強度。1.1.8無序蛋白最近十幾年，研究表明有些天然蛋白完全沒有或僅有很小一部分形成規(guī)正的二級結(jié)構(gòu)元件，整體呈現(xiàn)出伸展、靈活的無序狀態(tài)，被稱為天然無序蛋白質(zhì)（intrinsicallydisorderedprotein）、天然無結(jié)構(gòu)蛋白（intrinsicallyunstructuredprotein）或天生的變性/去折疊蛋白質(zhì)（natrualydenaturav/unfoldingprotein）。1996年，R.W.Kriwaeki利用核磁共振譜法研究一種阻止細胞瘋狂增殖的蛋白質(zhì)p21，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它完全沒有固定的構(gòu)象，而在這種無序狀態(tài)下，p21可正常地行使其功能。這種無序蛋白廣泛分布于各種生物：古細菌中約有2%的無序蛋白，真細菌中約有4.2%，酵母和人分別為18%和35%。與有序蛋白相比，天然無序蛋白質(zhì)中含有較多的具有極性側(cè)鏈基團的氨基酸殘基。迄今，大約已證實了600種全部或部分無序的蛋白質(zhì)的具體功能，涉及細胞周期的調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控以及多組分蛋白復(fù)合體的組裝。例如p27、p53、微管相關(guān)蛋白tau、老年性癡呆癥淀粉樣前體的非AB組分、需Ca2+蛋白酶抑制劑、抗σ28因子和核孔復(fù)合物中央通道內(nèi)填充的天然無序蛋白質(zhì)等。無序蛋白p27具有高度生命起源和生物大分子進化研究顯示，RNA很可能是最原初的生物催化劑和遺傳信息載體。一些原始的無序蛋白與RNA結(jié)合，幫助其正確折疊并維持生物活性需要的構(gòu)象。對遺傳密碼進化的研究支持在生命發(fā)生早期就形成了無序蛋白的觀點。天然無序蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)顛覆了蛋白質(zhì)必須在翻譯后經(jīng)歷跨膜轉(zhuǎn)位、翻譯后修飾和卷曲折疊，形成特定的天然構(gòu)象，才能具備生物學(xué)活性的傳統(tǒng)觀念，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究揭開了新的篇章。1.1.9生物超分子體系1.2蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的聯(lián)系了解蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是理解蛋白質(zhì)如何行使其功能的基礎(chǔ)。首先，蛋白質(zhì)功能總是跟蛋白質(zhì)與其它分子相互作用相聯(lián)系，被蛋白質(zhì)可逆結(jié)合的其它分子稱為配體。蛋白質(zhì)-配體相互作用的瞬時性質(zhì)對生命至關(guān)重要，因為它允許生物體在內(nèi)、外環(huán)境變化時，能迅速、可逆地作出反應(yīng)。蛋白質(zhì)上的配體結(jié)合部位與配體在大小、形狀、電荷以及疏水或親水性質(zhì)等方面都是互補的。其次，蛋白質(zhì)在特定的時空以其特有的結(jié)構(gòu)行使特定的功能，如果發(fā)生時空混亂，后果對細胞或機體很可能是災(zāi)難性的。例如，胰腺分泌的消化酶原本應(yīng)在進食后在腸腔內(nèi)激活，如在胰腺內(nèi)被激活，則會對胰腺自身造成廣泛破壞，導(dǎo)致急性胰腺炎。原癌基因產(chǎn)物對早期胚胎發(fā)育是必要的，成年后如果再過度表達則導(dǎo)致癌變。因此，深刻認識蛋白質(zhì)的時空特征，是從分子水平闡明許多生物學(xué)現(xiàn)象的重要基礎(chǔ)。1.2.1肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能肌紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)圖1.34抹香鯨肌紅蛋白的氨基酸序列，殘基符號上面的數(shù)字表示其順序號：肌紅蛋白（myoglobin）存在于肌肉中，能貯藏O2圖1.34抹香鯨肌紅蛋白的氨基酸序列，殘基符號上面的數(shù)字表示其順序號：圖1.35肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)肌紅蛋白多肽鏈中的殘基75~80%處于α-螺旋中，其余為無規(guī)卷曲，整個肽鏈有8個長短不一的螺旋段，即A、B、C、D、E、F、G、H，在側(cè)鏈基團相互作用下盤曲形成4.3nm×3﹒5nm×2.3nm圖1.35肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)肌紅蛋白分子表面有一狹縫，E螺旋和F螺旋位于狹縫兩側(cè)，形成一個疏水微環(huán)境。肌紅蛋白的輔基血紅素就結(jié)合在這個狹縫內(nèi)（圖1.35）。血紅素的側(cè)鏈丙酸基伸到分子表面，在生理pH下，它們帶負電荷，F(xiàn)e2+與卟啉環(huán)四個吡咯N原子配位，F(xiàn)8-His殘基咪唑環(huán)N-3占據(jù)第五個配位位置，F(xiàn)e2+在鄰接His（F8）一側(cè)，距離卟啉平面約0.03nm。O2占據(jù)第六配位位置，在卟啉平面另一側(cè)與血紅素可逆地結(jié)合。脫氧肌紅蛋白中第六配位空置；而在高鐵（Fe3+）肌紅蛋白中H2O占據(jù)這個位置。在狹縫另一邊E7His并未與血紅素結(jié)合，稱為遠側(cè)組氨酸，靠近第六配位位置（圖1.36）。圖圖1.36A血紅素結(jié)構(gòu)；B肌紅蛋白中O2肌紅蛋白由3個外顯子編碼：外顯子Ⅰ編碼1至30（NA1到B2），外顯子Ⅱ編碼31至105（B3至G6），外顯子Ⅲ編碼106至153（G7至HC5）。研究表明，39至139（C4到H14）的片段與血紅素結(jié)合關(guān)系密切。有人用蛋白酶從脫輔基肌紅蛋白N-端和C-端各切去一段，制備出相當(dāng)于32至139的多肽，加入血紅素后構(gòu)成微型肌紅蛋白，在體外系統(tǒng)能可逆地與O2結(jié)合，與天然肌紅蛋白相似。就氧合功能而言，1~31和140~153貢獻不大，但不排除這些片段在穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)、促進合成、折疊和運輸以及種系發(fā)生等方面可能的作用。肌紅蛋白的功能血紅素在水中可以短暫地氧合，然后形成血紅素-O2-血紅素夾層中間物，很快產(chǎn)生不能氧合的高鐵血紅素。雖然肌紅蛋白中真正與O2結(jié)合的是血紅素，但是肽鏈起著圍籬作用。由于血紅素結(jié)合在肽鏈繞成的疏水狹縫中，遠側(cè)His的位阻效應(yīng)防止了夾層復(fù)合物的形成，避免了Fe2+氧化或流失，使血紅素可以長時間可逆的氧合-放氧，完成O2載體的使命。同樣是血紅素輔基，在細胞色素中它是電子載體，在過氧化氫酶中參與過氧化氫分解為水和氧的催化過程?？梢娸o基的功能在一定程度上依賴于它所結(jié)合的多肽鏈提供的微環(huán)境。為了給肌紅蛋白肽鏈的圍籬作用提供實驗支持，James和Collman合成了圍籬鐵卟啉復(fù)合物，在鐵卟啉平面一側(cè)，有一個咪唑衍生物占據(jù)Fe2+第五個配位位置，另一側(cè)有疏水側(cè)鏈基團形成保護O2結(jié)合的圍籬（圖1.37），它對O2的親和力與肌紅蛋白相仿。圖圖1.37左圍籬復(fù)合物的結(jié)構(gòu)式；右圍籬復(fù)合物氧合示意圖結(jié)合了氧的圍籬鐵卟啉的示意圖。圍籬防止了兩個這樣的卟啉合在一起形成氧化中的主要中間體。CO是許多含碳物質(zhì)不完全燃燒的產(chǎn)物，也是血紅素在體內(nèi)降解的產(chǎn)物之一。游離血紅素對CO的親和力比對O2的親和力大25000倍；而肌紅蛋白對CO的親和力僅比對O2的親和力大200倍。這是因為游離血紅素與CO結(jié)合時，C-Fe2+鍵與C=O鍵在一條直線上；而血紅素與O2結(jié)合時Fe2+-O鍵與O=O鍵之間形成121°的夾角。在肌紅蛋白中，遠側(cè)His（E7）的存在對其與CO的結(jié)合顯然會產(chǎn)生更大的位阻效應(yīng)，結(jié)果大大降低了對CO的親和力和CO中毒的危險，保證在生理條件下肌紅蛋白能有效地履行貯藏和輸送O2的功能（圖1.38）。圖1.38肌紅蛋白對CO低親和力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)A.CO與游離血紅素以直線方式結(jié)合；B圖1.38肌紅蛋白對CO低親和力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)A.CO與游離血紅素以直線方式結(jié)合；B.CO與肌紅蛋白結(jié)合時，遠側(cè)His的位阻效應(yīng)大大降低了對CO的親和力；C.O2與肌紅蛋白的結(jié)合1.2.2血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能血紅蛋白（hemoglobin,Hb）存在于脊椎動物紅細胞中，是運輸O2和CO2的工具。Hb是第一個得到X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析初步結(jié)果的蛋白質(zhì)，還是第一個與生理功能相聯(lián)系的蛋白質(zhì)。從異常血紅蛋白一級結(jié)構(gòu)研究中提出了分子病的概念，從Hb與O2結(jié)合中發(fā)現(xiàn)了協(xié)同效應(yīng)。從而成為迄今認識蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系最好的范例。血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)血紅蛋白由四個亞基組成（α2β2），每個亞基含一條多肽鏈和1個血紅素輔基。α亞基多肽有141個氨基酸殘基，β亞基多肽鏈有146個氨基酸殘基，二者有60個相同，約占42%，其中有23個殘基與Mb相同。Hb的亞基與Mb的氨基酸序列雖有明顯不同，但血紅素結(jié)合部卻非常保守，而且它們的二、三級結(jié)構(gòu)也十分相似，仔細對比也有一些差異（表1.5）。表1.5血紅蛋白α-和β-鏈與肌紅蛋白二、三級結(jié)構(gòu)的異同肽鏈區(qū)段肌紅蛋白（Mb）α-鏈（α）β-鏈（β）A螺旋α-螺旋=Mb=MbAB非螺旋非螺旋A16-B1不同少2個殘基B螺旋α-螺旋=Mb=MbBC螺旋非螺旋=Mb=MbC螺旋α-螺旋有310螺旋有310螺旋CD螺旋無規(guī)卷曲都不同于MbCD5~7不同于MbD螺旋α-螺旋不存在=MbE螺旋α-螺旋無規(guī)卷曲E18~20為無規(guī)卷曲EF螺旋無規(guī)卷曲EF2~5不同于Mb（α=β）F螺旋α-螺旋=Mb=MbFG螺旋無規(guī)卷曲=Mb=MbG螺旋α-螺旋G1~3為310螺旋（α=β）GH螺旋無規(guī)卷曲≈MbGH1~3不同于MbH螺旋α-螺旋基（24個殘基）含20個殘基（α=β）HC螺旋含5個殘基含3個殘基（α=β）殘基總數(shù)153141146血紅蛋白的四個亞基按四面體排布，亞基間凹凸互補，構(gòu)成一個6.5×5.5×5nm的四面體。兩個α與兩個β亞基按雙重對稱軸排布，沿X或Y軸旋轉(zhuǎn)180°，外形相似；沿Y軸兩個α與兩個β亞基間均有空隙，形成中心空穴（圖1.39）。α1/β1或α2/β2之間接觸面較大，包括G10~H9之間以及B、D螺旋的34個殘基，由17~19個氫鍵將其締合成穩(wěn)定的二聚體（α1/β1和α2/β2），不受血紅素和O2結(jié)合的影響。α1/β2或α2/β1之間接觸面較小，涉及α1的CD和β2的FG非螺區(qū)中19個殘基，將兩個二聚體締合為四聚體，此種結(jié)合易受O2和血紅素結(jié)合的影響。圖圖1.39血紅蛋白分子的四級結(jié)構(gòu)A.α2β2四面體排布示意圖B.氧合血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)脫氧血紅蛋白中，亞基間的靜電相互作用（圖1.40），以及分子中心空穴周圍兩個β鏈的N-端-NH3+、Lys-82(EF6)、His-2和His143（HCl）共8個正電荷與空穴中的效應(yīng)劑分子2，3-二磷酸甘油酸（BPG）之間靜電相互作用（圖1.41）對穩(wěn)定脫氧血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要作用。這些靜電相互作用在血紅蛋白氧合后不復(fù)存在。血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)Mb和Hb均為儲藏和運輸O2的載體，Mb是單體，Hb為四聚體，在氧分壓較低時Mb對O2的親和力遠大于Hb，如以P50表示一半結(jié)合部位被O2飽和時的氧分壓，Hb的P50=26Torr，Mb的P50=1Torr。Mb+O2MbO2設(shè)K為MbO2解離常數(shù)，則K=；若Y為Mb氧飽和度，則Y=；用pO2代替[O2]，P50代替K，上式改寫為：Y=，是一個典型的雙曲線方程圖1.40脫氧血紅蛋白中亞基間的靜電相互作用圖1.41BPG與脫氧血紅蛋白分子中心空穴周圍正電荷的相互作用對Hb來說，Hb+nO2Hb（O圖1.40脫氧血紅蛋白中亞基間的靜電相互作用圖1.41BPG與脫氧血紅蛋白分子中心空穴周圍正電荷的相互作用Y=取對數(shù)，上式即Hill方程，是一個直線方程，Y=0.5時n（斜率）值即為Hill系數(shù)。Mb的n=1，Hb的n=2.8，表明Hb與O2結(jié)合存在協(xié)同效應(yīng)（或變構(gòu)效應(yīng)），即先結(jié)合的O2影響同一分子中空閑的O2結(jié)合部位對后續(xù)O2的親和力（詳見別構(gòu)酶一節(jié)）。若以縱坐標(biāo)表示Y，橫坐標(biāo)表示pO2，Mb的氧合曲線為雙曲線，Hb的是S型曲線（圖1.42）。圖1.42Mb和Hb的氧合曲線Hb的氧合曲線反映了HbO2的解離特征：即在氧分壓較高的區(qū)間，只有很少HbO2解離，表現(xiàn)為S型曲線上段；在氧分壓很低時，只剩下不多的HbO2緩慢地解離，表現(xiàn)為S型曲線下段；只有在S型曲線中段相應(yīng)的氧分壓區(qū)間，HbO2隨pO2下降快速解離。如果肺泡中pO2=100Torr，活動肌肉毛細血管中pO2=20Torr,P50=30Torr,n=2.8，在肺泡中Y=0.97，在活動肌肉毛細血管中Y=0.25，二者之差ΔY=0.72，即在此條件下血液從肺泡流到活動肌肉中將釋放所攜帶的72%的O2。假如沒有協(xié)同效應(yīng)，即n=1，其他條件不變，那么Y肺泡=0.77，Y毛細血管=0.41，ΔY=0.36，可見在同樣條件下協(xié)同效應(yīng)使Hb的O2釋放量增加一倍。實際測算表明，pO2從100降至20Torr,MbO2只釋放10%的O圖1.42Mb和Hb的氧合曲線人體的血紅蛋白除HbA（α2β2）外，還有HbA2（α2δ2）和HbF（α2γ2）。β、γ、δ鏈的一級結(jié)構(gòu)僅有個別氨基酸不同，二、三級結(jié)構(gòu)十分相似。成人血液中HbA2僅占2%，HbF不到1%，而胎兒血液中HbF是主要血紅蛋白，在足月的新生兒血液中HbF占70~80%。在生理條件下，HbF對O2的親和力大于HbA，使得胎兒通過胎盤循環(huán)從母體得到O2（圖1.43）。Hb對O2的親和力對pH和[CO2]的變化敏感，pH值下降時，Hb對O2的親和力降低，HbO2解離曲線右移，S型漸趨雙曲線型。實際上血液pH變化很小，而[CO2]增大同樣導(dǎo)致Hb對O2的親和力下降。Hbα鏈N-端氨基可逆地與CO2結(jié)合。在代謝活躍的組織中，[CO2]增大或pH下降促進HbO2放O2，而O2的釋放又促進Hb與CO2結(jié)合，這種現(xiàn)象稱為Bohr效應(yīng)（圖1.44）。在代謝活躍的組織中在肺泡中HCO2HbO2+CO2+H+在代謝活躍的組織中在肺泡中HCO2圖圖1.44pH值和CO2分壓對HbO2解離曲線的影響（1）pH7.6（pCO2=25.5mmHg柱）.（2）pH7.4（pCO2=39.7mmHg柱）（3）pH7.2（pCO2=61.3mmHg柱）圖1.43胎兒血紅蛋白對O2的親和力較高1967年，ReinholdBenesch和RuthBenesch發(fā)現(xiàn)2，3-二磷酸甘油酸是血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)劑。在成熟的人紅細胞中[Hb]≈[BPG]，每個Hb在其中央空穴結(jié)合一分子BPG，通過與周圍正電荷集團的相互作用使Hb的四級結(jié)構(gòu)更趨穩(wěn)定（見圖1.40）。如果沒有BPG，H血紅蛋白別構(gòu)效應(yīng)的分子機制Hbα-亞基的單體具有對O2的高親和力，氧合曲線為雙曲線，與Mb極為相似。孤立的β亞基易形成四聚體，β4被稱為HbH，沒有HbA的變構(gòu)效應(yīng)。因此，血紅蛋白的別構(gòu)性質(zhì)來源于亞基間的相互作用。（1）氧合中血紅素鐵原子的變化：在脫氧血紅蛋白中，由于連接血紅素的F8His咪唑環(huán)與血紅素卟啉環(huán)間的位阻斥力，以及血紅素鐵外層電子處于高自旋狀態(tài)，半徑較大，不能進入卟啉環(huán)中央小孔，而離開卟啉平面約0.06nm；同時血紅素向F8His方向稍微隆起，呈現(xiàn)圓頂形（圖1.46）。在氧合過程中，鐵外層電子變成低自旋狀態(tài)，半徑縮小了13%，移動0.06nm，進入卟啉平面中央小孔，血紅素完全呈平面狀態(tài)。血紅素的狀態(tài)既受O2結(jié)合的影響，又依賴于Hb整體的四級結(jié)構(gòu)。圖圖1.45BPG對Hb氧合曲線的影響圖1.46血紅蛋白氧合時鐵原子移近血紅素平面近側(cè)組氨酸（F8）與鐵原子一起被拉動，F(xiàn)e-N鍵變成垂直于血紅素平面（2）亞基三級結(jié)構(gòu)的變化：在血紅蛋白亞基中，血紅素及F8His與鄰近的15個側(cè)鏈基團有緊密的聯(lián)系。因此，氧合過程中鐵原子的位移牽動F8His位移以及F螺旋、EF和FG片段等的位移（圖1.47）。F螺旋向H螺旋移動二者之間的空隙變小，迫使HC2的Tyr側(cè)鏈從隙中移開，導(dǎo)致鏈間鹽鍵的斷裂。這樣，血紅素上氧合引起的變化，觸發(fā)亞基內(nèi)部的構(gòu)象改變，導(dǎo)致亞基交界面上的結(jié)構(gòu)改變。圖1.47氧合過程中鐵原子位移引發(fā)的構(gòu)象改變虛線代表氧合前的位置，實線表示氧合后的位置（3）四級結(jié)構(gòu)的變化：氧合引發(fā)的構(gòu)象變化傳遞到亞基界面上，促使兩個原體(α1β1)與（α2β2）相對旋轉(zhuǎn)15°，平移0.08nm（圖1.48）。脫氧狀態(tài)時α1亞基C7Tyr-42酚基與β2亞基G1Asp99羧基間的氫鍵，在氧合引起的亞基位移中被破壞，而在α1亞基G1Asp9的羧基與β2圖1.47氧合過程中鐵原子位移引發(fā)的構(gòu)象改變虛線代表氧合前的位置，實線表示氧合后的位置氧合過程中亞基的旋轉(zhuǎn)和位移，使維持四級結(jié)構(gòu)的鹽鍵斷裂，兩個β亞基的鐵原子間的距離從3.99減為3.31nm，分子中央空穴變小以致容納不下BPG。鹽鍵的斷裂也引起β亞基的構(gòu)象改變，如E11Val側(cè)鏈移開，解除了O2結(jié)合的空間位阻。按照序變模型，上述血紅蛋白氧合過程變構(gòu)效應(yīng)的機制概括于圖1.50。圖1.50血紅蛋白氧合過程中構(gòu)象變化編碼血紅蛋白多肽鏈的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致個別氨基酸取代、缺失，肽段融合，延長甚至整個肽鏈的缺失，形成300種以上的異常血紅蛋白。由于取代發(fā)生的位置、范圍、性質(zhì)各不相同，對血紅蛋白結(jié)構(gòu)和正常功能的影響也就有所不同，有的異常血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能均無重大改變，有些異常血紅蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化而導(dǎo)致疾病，因此，對于闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的聯(lián)系極有參考價值。根據(jù)變異的性質(zhì)，可將異常血紅蛋白分為以下四類：圖1.51脫氧HbS形成細長的螺旋纖維黑三角表示粘斑，缺口表示粘斑互補部位（1）分子表面發(fā)生變異的Hb:分子表面發(fā)生取代的異常Hb已發(fā)現(xiàn)一百多種，絕大多數(shù)不影響Hb的穩(wěn)定性和功能，在臨床上是無害的。但有少數(shù)可引起臨床癥狀，尤其是鐮刀狀紅細胞貧血癥，患者紅細胞含異常的HbS，紅細胞呈鐮刀形，易破碎，壽命短，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的貧血，甚至危及生命?，F(xiàn)已查明，鐮刀狀紅細胞貧血患者編碼珠蛋白β鏈的基因有一個堿基突變（T→A）結(jié)果β6（A3）的Glu被Val取代，致使HbS比HbA少2~4個負電荷，pI從6.68增至6.91，在脫氧狀態(tài)下溶解度僅為HbA的1/25。Val取代Glu使HbS每個亞基外側(cè)產(chǎn)生一個粘斑，而脫氧HbS還有與粘斑互補的部位，互相粘結(jié)，形成細長的脫氧HbS聚合體（圖1.51）。幾股這樣的聚合體盤旋纏繞，形成在電鏡下可見的直徑為17nm和21.5nm的兩種纖維。直徑21.5nm的螺旋纖維更常見，有14股螺旋纖維。這些纖維使紅細胞變成易碎的鐮刀形。紅細胞破碎后釋放出HbS纖維，使血液粘度增大，血流不暢，小血管阻塞，造成供O2不足又惡性循環(huán)地導(dǎo)致形成更多的鐮刀形紅細胞。被釋放的HbS隨即被降解，以致造成嚴(yán)重的貧血，最后危及生命。純合子（HbS/HbS）患者紅細胞中HbS圖1.51脫氧HbS形成細長的螺旋纖維黑三角表示粘斑，缺口表示粘斑互補部位（2）血紅素結(jié)合部位發(fā)生變異的Hb：Hb每個亞基都有一個結(jié)合血紅素的疏水性裂隙，除結(jié)合血紅素的F8His和E7His外，其余與血紅素接觸的19個殘基有15個是疏水殘基。上述殘基發(fā)生取代涉及到血紅素的結(jié)合及Hb的穩(wěn)定性。影響的大小和臨床癥狀的嚴(yán)重程度取決于取代殘基的性質(zhì)。例如HbM為E7或F8His被Tys取代，帶負電荷的酚基與Fe3+形成絡(luò)合物，把血