mRNA差異顯示技術解讀課件

mRNA差別顯示技術林寶山120906032595臨床獸醫(yī)學2012級mRNA差別顯示技術林寶山120906032595臨床主要內(nèi)容

一、概述：mRNA差異顯示技術二、DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎三、mRNA差異顯示技術的原理：四、DDRT-PCR目前的應用領域五、DDRT-PCR一般操作步驟七、DDRT-PCR的技術改進

六、DDRT-PCR的優(yōu)點及缺點主要內(nèi)容一、概述：mRNA差異顯示技術二、一.概述：mRNA差異顯示技術

高等生物大約有3~5萬個不同的基因，在每一個正常的體細胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達，這種選擇性表達是在發(fā)育過程中細胞分化的根本原因，是調(diào)控細胞生命活動過程的核心機制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理條件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達差異，可分離并克隆出這些特異性表達的基因。研究基因差異表達的主要技術有差別雜交(differentialhybridization)扣除（消減）雜交(Subtractivehybridization)mRNA差異顯示技術(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR)抑制消減雜交法(suppressialsubstractivehybridization,SSH)代表性差異分析(Representialdisplayanalysis,RDA)交互扣除RNA差別顯示技術(RSDD)以及基因表達系列分析和電子消減一.概述：mRNA差異顯示技術高等生物大約有3~mRNA差異顯示PCR技術是1992年由美國波斯頓Dena-Faber癌癥研究所的LiangPeng博士和ArthurPardee博士建立起來的一種用于鑒定和克隆哺乳動物正常生理狀態(tài)和異常狀態(tài)細胞之間差異表達基因的方法,是目前篩選差異表達基因最有效的方法,同時，研究mRNA差異相對于研究DNA差異而言。它排出了非編碼區(qū)（內(nèi)含子）的影響，從而使得研究結果更加接近于真實。1、mRNA差別顯示技術：mRNA差異顯示PCR技術是1992年由美國波斯頓Dena-二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達基因強有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術方面做了大量改進，使技術更適用、更簡便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術1）RT-PCR技術2）以特定引物進行的PCR技術3）DNA電泳技術二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎由Liang于1992年三、mRNA差異顯示技術的原理：

mRNA差異顯示技術的主要原理是利用cDNA反轉錄技術,PCR擴增和高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，來顯示PCR產(chǎn)物的差異。其中，反轉錄技術中使用了一系列能與mRNA的Poly（A）尾巴相結合的錨定寡聚脫氧核苷酸引物OligoT12MN。錨定引物與mRNA的Poly（A）+的兩個堿基，在反轉錄酶的作用下可以啟動mRNA群體反轉錄。三、mRNA差異顯示技術的原理：mRNA差異顯示技術5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉錄5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動cDNA第一鏈合成不同長度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴增，克隆測序，同源比對隨機結合到cDNA鏈上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly四.DDRT-PCR目前的應用領域主要用于醫(yī)學研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、生殖等領域動植物遺傳、育種，動物營養(yǎng)及微生物等領域四.DDRT-PCR目前的應用領域主要用于醫(yī)學研究的癌癥、神五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉錄RT-PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳及差異DNA條帶的回收PCR在擴增及其產(chǎn)物的回收測序和數(shù)據(jù)庫比對分析實時定量PCR五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉錄mRNA差異顯示技術簡略流程圖mRNA差異顯示技術簡略流程圖六.DDRT-PCR的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA可以同時比較多個樣品間基因表達的差異可以同時檢測到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時間短，實驗過程中可步步驗證比較可進行多基因家族的表達分析六.DDRT-PCR的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為

七.DDRT-PCR的缺點假陽性高樣品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染單條帶可能由一種以上cDNA片段所構成有些特異cDNA片段太短,在Northern雜交時檢測不到雜交信號PCR擴增了一些稀有mRNA片段,在雜交時顯示不出差異表達的信號絕大多數(shù)差異條帶僅含有3’-UTR500bp以內(nèi)的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結構相對保守，得不到特異的基因對低豐度mRNA檢出率低七.DDRT-PCR的缺點假陽性高八.DDRT-PCR的技術改進針對以上不足,特別是假陽性率高的缺點，從以下幾個方面做了大量改進：引物設計反應條件的優(yōu)化顯示方法假陽性鑒定八.DDRT-PCR的技術改進針對以上不足,特別是假陽性率高引物設計mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果最好王夏等在T12MN之前加上了一段T7啟動子序列，提高了PCR反應的嚴謹性Liang發(fā)現(xiàn)9~10個mer長度的隨機引物比較適宜Liang還發(fā)現(xiàn)，當長度為13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位點，能更有效的擴增，并能提高特異性引物設計mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果反應條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時，能擴增出較多的條帶不同條件下dNTP濃度不是固定不變的1.5-2.0mmol/L的Mg2+濃度效果較好40-42℃的退火溫度通常能得到較好的擴增效果，周寧新等在PCR的頭兩個循環(huán)，用低嚴謹?shù)耐嘶饻囟?6℃，在隨后的循環(huán)中退火溫度提高到45℃，獲得了很清晰的電泳圖譜反應條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時，能擴增出較多的條帶顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進行放射自顯影成像Sanguinetti介紹了一個快速銀染方法，只需15分鐘，而且容易克隆回收Rompf等通過瓊脂糖凝膠電泳分辨差異cDNA片段余桂華等建立了熒光mRNA差異顯示方法，最大限度地降低了假陽性顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進行放假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個主要手段；分析較多條帶，反向Northernblot是較為切合實際的選擇Heinz通過SSCP分析排除了非差異表達的cDNA污染Callard把純化后的PCR產(chǎn)物分成兩部分:一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆Sompayra設計了向5’步移的方法假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個主要mRNA差異顯示技術現(xiàn)在已經(jīng)成功運用于動物的胚胎發(fā)育、組織分化、生長因子激活與抑制、細胞周期控制、癌變及疾病相關基因的鑒定和克隆，在植物無性繁殖、形態(tài)發(fā)生、次生代謝、抗逆抗病等方面被用來進行基因的鑒定、克隆以及功能研究，并取得很好的結果。概括起來其主要用途可以歸納為以下三點：第一，尋找差異表達的基因。第二，研究個體、種群或品種間轉錄水平上的遺傳變異。第三，鑒定經(jīng)濟動物中控制重要數(shù)量經(jīng)濟性狀位點的基因。九、mRNA差異顯示技術的實際應用：mRNA差異顯示技術現(xiàn)在已經(jīng)成功運用于動物的胚胎發(fā)育、組織分由于人們認識的基因還不夠全面，特別是對生物發(fā)生、發(fā)育及病理生理過程中某些新的功能基因和調(diào)控作用認識不足，因此差異顯示技術將在研究生物進化、損傷修復、癌變及治療反應過程中具有重要意義。差顯技術的發(fā)現(xiàn)為在該領域中尋找新基因提供了有用的工具。相信隨著不斷的應用和技術的不斷改善，差異顯示技術必越來越多的在生命科學以及醫(yī)學領域的基因鑒定、克隆等方面起到更大的作用，對揭示生物界基因表達調(diào)控的奧秘將起重要作用。經(jīng)過近幾年的研究，在提高重復性，降低假陽性方面有所改進，尤其mRNA差異顯示試劑盒的商品化，為mRNA差異顯示提供了成套試劑，mRNA差異顯示技術將會越來越廣泛的應用于生命科學的研究。對進一步揭開基因表達調(diào)控的奧秘，將發(fā)揮越來越大的作用。對mRNA差別顯示技術的展望：由于人們認識的基因還不夠全面，特別是對生物發(fā)生、

mRNA差別顯示技術林寶山120906032595臨床獸醫(yī)學2012級mRNA差別顯示技術林寶山120906032595臨床主要內(nèi)容

一、概述：mRNA差異顯示技術二、DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎三、mRNA差異顯示技術的原理：四、DDRT-PCR目前的應用領域五、DDRT-PCR一般操作步驟七、DDRT-PCR的技術改進

六、DDRT-PCR的優(yōu)點及缺點主要內(nèi)容一、概述：mRNA差異顯示技術二、一.概述：mRNA差異顯示技術

高等生物大約有3~5萬個不同的基因，在每一個正常的體細胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達，這種選擇性表達是在發(fā)育過程中細胞分化的根本原因，是調(diào)控細胞生命活動過程的核心機制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理條件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達差異，可分離并克隆出這些特異性表達的基因。研究基因差異表達的主要技術有差別雜交(differentialhybridization)扣除（消減）雜交(Subtractivehybridization)mRNA差異顯示技術(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR)抑制消減雜交法(suppressialsubstractivehybridization,SSH)代表性差異分析(Representialdisplayanalysis,RDA)交互扣除RNA差別顯示技術(RSDD)以及基因表達系列分析和電子消減一.概述：mRNA差異顯示技術高等生物大約有3~mRNA差異顯示PCR技術是1992年由美國波斯頓Dena-Faber癌癥研究所的LiangPeng博士和ArthurPardee博士建立起來的一種用于鑒定和克隆哺乳動物正常生理狀態(tài)和異常狀態(tài)細胞之間差異表達基因的方法,是目前篩選差異表達基因最有效的方法,同時，研究mRNA差異相對于研究DNA差異而言。它排出了非編碼區(qū)（內(nèi)含子）的影響，從而使得研究結果更加接近于真實。1、mRNA差別顯示技術：mRNA差異顯示PCR技術是1992年由美國波斯頓Dena-二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達基因強有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術方面做了大量改進，使技術更適用、更簡便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術1）RT-PCR技術2）以特定引物進行的PCR技術3）DNA電泳技術二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎由Liang于1992年三、mRNA差異顯示技術的原理：

mRNA差異顯示技術的主要原理是利用cDNA反轉錄技術,PCR擴增和高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，來顯示PCR產(chǎn)物的差異。其中，反轉錄技術中使用了一系列能與mRNA的Poly（A）尾巴相結合的錨定寡聚脫氧核苷酸引物OligoT12MN。錨定引物與mRNA的Poly（A）+的兩個堿基，在反轉錄酶的作用下可以啟動mRNA群體反轉錄。三、mRNA差異顯示技術的原理：mRNA差異顯示技術5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉錄5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動cDNA第一鏈合成不同長度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴增，克隆測序，同源比對隨機結合到cDNA鏈上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly四.DDRT-PCR目前的應用領域主要用于醫(yī)學研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、生殖等領域動植物遺傳、育種，動物營養(yǎng)及微生物等領域四.DDRT-PCR目前的應用領域主要用于醫(yī)學研究的癌癥、神五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉錄RT-PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳及差異DNA條帶的回收PCR在擴增及其產(chǎn)物的回收測序和數(shù)據(jù)庫比對分析實時定量PCR五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉錄mRNA差異顯示技術簡略流程圖mRNA差異顯示技術簡略流程圖六.DDRT-PCR的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA可以同時比較多個樣品間基因表達的差異可以同時檢測到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時間短，實驗過程中可步步驗證比較可進行多基因家族的表達分析六.DDRT-PCR的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為

七.DDRT-PCR的缺點假陽性高樣品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染單條帶可能由一種以上cDNA片段所構成有些特異cDNA片段太短,在Northern雜交時檢測不到雜交信號PCR擴增了一些稀有mRNA片段,在雜交時顯示不出差異表達的信號絕大多數(shù)差異條帶僅含有3’-UTR500bp以內(nèi)的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結構相對保守，得不到特異的基因對低豐度mRNA檢出率低七.DDRT-PCR的缺點假陽性高八.DDRT-PCR的技術改進針對以上不足,特別是假陽性率高的缺點，從以下幾個方面做了大量改進：引物設計反應條件的優(yōu)化顯示方法假陽性鑒定八.DDRT-PCR的技術改進針對以上不足,特別是假陽性率高引物設計mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果最好王夏等在T12MN之前加上了一段T7啟動子序列，提高了PCR反應的嚴謹性Liang發(fā)現(xiàn)9~10個mer長度的隨機引物比較適宜Liang還發(fā)現(xiàn)，當長度為13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位點，能更有效的擴增，并能提高特異性引物設計mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果反應條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時，能擴增出較多的條帶不同條件下dNTP濃度不是固定不變的1.5-2.0mmol/L的Mg2+濃度效果較好40-42℃的退火溫度通常能得到較好的擴增效果，周寧新等在PCR的頭兩個循環(huán)，用低嚴謹?shù)耐嘶饻囟?6℃，在隨后的循環(huán)中退火溫度提高到45℃，獲得了很清晰的電泳圖譜反應條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時，能擴增出較多的條帶顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進行放射自顯影成像Sanguinetti介紹了一個快速銀染方法，只需15分鐘，而且容易克隆回收Rompf等通過瓊脂糖凝膠電泳分辨差異cDNA片段余桂華等建立了熒光mRNA差異顯示方法，最大限度地降低了假陽性顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進行放假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個主要手段；分析較多條帶，反向Northernbl