52多聚酶鏈式反應擴增DNA片段匯總課件

課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段1DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進行比較，就有可能為案件的偵破提供證據(jù)。討論：1.犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的DNA呢？2.你還能說出DNA鑒定技術在其他方面的應用嗎？DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場的血252多聚酶鏈式反應擴增DNA片段匯總課件3★分子生物學研究中最強大的實驗技術之一★其本質是在體外模擬細胞內DNA分子復制的過程美國科學家穆里斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術1993年諾貝爾獎

★分子生物學研究中最強大的實驗技術之一美國科學家穆里斯(K4（一）DNA分子的結構C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一、基礎知識脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）（一）DNA分子的結構C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核5一個核苷酸上的磷酸基團上的“－OH”和另一個核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’，5’-磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團的末端稱為5’端3.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈結構簡圖一個核苷酸上的磷酸基團上的“－OH”和另一個核苷酸分子的第36DNA分子的平面結構ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端識別：-OH端為3′;磷酸基團的末端為5′。DNA分子的平面結構ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端37（1）DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結構。4.DNA雙螺旋結構特點：（2）

與

交替連結，排列在外側，構成基本骨架；

排列在鏈的內側。（3）兩條鏈上的堿基通過

連結起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤（A）一定與

配對，鳥嘌呤（G）一定同

配對。兩條反向平行雙螺旋脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）（1）DNA分子是由的（即一條鏈8（二）DNA的復制：1.概念：由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程。2.時期：有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場所：細胞核（主要）、線粒體、葉綠體4.基本條件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈（二）DNA的復制：1.概念：由一個DNA形成兩個完全相同的95.復制特點：a.邊解旋邊復制b.半保留復制6.遵循原則：堿基互補配對原則7.精確復制的原因a.規(guī)則的雙螺旋結構為復制提供了精確的模板b.堿基互補配對保證了復制準確無誤的進行8.復制的意義:DNA分子通過復制將遺傳信息從親代傳給了后代，保持了遺傳信息的連續(xù)性。5.復制特點：a.邊解旋邊復制b.半保留復制6.遵循原則：堿10參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結：細胞內DNA復制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸11解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈的原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3′端開始連接脫氧核苷酸

思考：體外擴增DNA時，如何提供與體內DNA復制相似條件？

變性（80～100℃

）TaqDNA聚合酶（耐高溫）20～30個核苷酸構成DNA或RNA解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打12二、PCR（多聚酶鏈式反應）（一）PCR原理DNA雙鏈變性（加熱80-100℃

）復性（緩慢冷卻）DNA單鏈變性的目的：解開雙鏈復性的目的：有利于引物1和引物2與兩條單鏈的結合二、PCR（多聚酶鏈式反應）（一）PCR原理DNA雙鏈變性（13PCR擴增儀PCR擴增儀實際上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，它可以根據(jù)DNA的熱變性原理，通過自動改變溫度，達到擴增DNA片段的目的。PCR擴增儀PCR擴增儀實際上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器141234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復性重復1～3步30輪DNA復制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸變性→復性（退火）→

延伸（二）PCR的反應過程：1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高15（二）PCR的反應過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/（二）PCR的反應過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3165引物15引物2第二次復制第一次復制555555模板DNA5555555525～30次循環(huán)（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。5引物15引物2第二次復制第一次復制555517DNA母鏈：解旋酶(條件）：4種脫氧核苷酸：DNA聚合酶（條件）：ATP：引物：緩沖溶液適宜溫度（三）PCR反應的條件80—100℃：耐熱的DNA聚合酶DNA母鏈：（三）PCR反應的條件80—100℃：耐熱的18三、PCR實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5mL3、微量移液器用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質上是能夠自動調控溫度的儀器三、PCR實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具2、微量離心1952多聚酶鏈式反應擴增DNA片段匯總課件204、離心機一種通過高速轉動產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的設備。4、離心機一種通過高速轉動產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的21（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序（反應）循環(huán)數(shù)變性復性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步驟：（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）循環(huán)數(shù)變性復性延22四、結果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照調零→測定→計算50倍蒸餾水做對照波長260nm處讀數(shù)四、結果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照23（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、a條DNA，復制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條D24光吸收波長／nm2602402202800.10.2光吸收波長／nm2602402202800.10.2252、過程①稀釋2μL

PCR反應液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)2、過程①稀釋2μLPCR反應液，加入98μL蒸餾水，即2650：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA的含量為50g/mL紫外分光光度計比色杯50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA的含量為27體內DNA復制與PCR的技術區(qū)別：體內復制PCR技術解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。半保留復制，完全解旋后復制，從模板鏈的一端開始復制。復制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸體內DNA復制與PCR的技術區(qū)別：體內復制PCR技術解旋在解28課堂小結多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR儀設置工作參數(shù)DNA擴增測定含量稀釋調零測定并讀數(shù)計算課堂小結多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需29課堂練習填空題1.PCR儀加熱使（）變性,復性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料合成新鏈。2.PCR經(jīng)（）三個階段為一個循環(huán)。DNA互補72℃Tap酶4種dNTP變性、復性、延伸課堂練習填空題1.PCR儀加熱使（）變性,復性30選擇題1.PCR反應產(chǎn)物的特異性取決于()A退火溫度B引物堿基組成和長度C循環(huán)次數(shù)D.A+B+CD2.PCR實驗的特異性主要取決于（）A.DNA聚合酶的種類B.反應體系中模板DNA的量C.引物序列的結構和長度D.四種dNTP的濃度C選擇題1.PCR反應產(chǎn)物的特異性取決于()D313.做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進行的關鍵步驟是A.反復洗滌B.不怕外源DNA污染C.高壓滅菌D.在-20℃儲存4.PCR技術最突出的優(yōu)點是A.原理簡單B.原料易獲得C.TaqDNA聚合酶有耐熱性D.快速、高效、靈活、易于操作3.做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須32課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段33DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進行比較，就有可能為案件的偵破提供證據(jù)。討論：1.犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的DNA呢？2.你還能說出DNA鑒定技術在其他方面的應用嗎？DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場的血3452多聚酶鏈式反應擴增DNA片段匯總課件35★分子生物學研究中最強大的實驗技術之一★其本質是在體外模擬細胞內DNA分子復制的過程美國科學家穆里斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術1993年諾貝爾獎

★分子生物學研究中最強大的實驗技術之一美國科學家穆里斯(K36（一）DNA分子的結構C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一、基礎知識脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）（一）DNA分子的結構C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核37一個核苷酸上的磷酸基團上的“－OH”和另一個核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’，5’-磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團的末端稱為5’端3.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈結構簡圖一個核苷酸上的磷酸基團上的“－OH”和另一個核苷酸分子的第338DNA分子的平面結構ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端識別：-OH端為3′;磷酸基團的末端為5′。DNA分子的平面結構ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端339（1）DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結構。4.DNA雙螺旋結構特點：（2）

與

交替連結，排列在外側，構成基本骨架；

排列在鏈的內側。（3）兩條鏈上的堿基通過

連結起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤（A）一定與

配對，鳥嘌呤（G）一定同

配對。兩條反向平行雙螺旋脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）（1）DNA分子是由的（即一條鏈40（二）DNA的復制：1.概念：由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程。2.時期：有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場所：細胞核（主要）、線粒體、葉綠體4.基本條件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈（二）DNA的復制：1.概念：由一個DNA形成兩個完全相同的415.復制特點：a.邊解旋邊復制b.半保留復制6.遵循原則：堿基互補配對原則7.精確復制的原因a.規(guī)則的雙螺旋結構為復制提供了精確的模板b.堿基互補配對保證了復制準確無誤的進行8.復制的意義:DNA分子通過復制將遺傳信息從親代傳給了后代，保持了遺傳信息的連續(xù)性。5.復制特點：a.邊解旋邊復制b.半保留復制6.遵循原則：堿42參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結：細胞內DNA復制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸43解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈的原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3′端開始連接脫氧核苷酸

思考：體外擴增DNA時，如何提供與體內DNA復制相似條件？

變性（80～100℃

）TaqDNA聚合酶（耐高溫）20～30個核苷酸構成DNA或RNA解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打44二、PCR（多聚酶鏈式反應）（一）PCR原理DNA雙鏈變性（加熱80-100℃

）復性（緩慢冷卻）DNA單鏈變性的目的：解開雙鏈復性的目的：有利于引物1和引物2與兩條單鏈的結合二、PCR（多聚酶鏈式反應）（一）PCR原理DNA雙鏈變性（45PCR擴增儀PCR擴增儀實際上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，它可以根據(jù)DNA的熱變性原理，通過自動改變溫度，達到擴增DNA片段的目的。PCR擴增儀PCR擴增儀實際上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器461234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復性重復1～3步30輪DNA復制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸變性→復性（退火）→

延伸（二）PCR的反應過程：1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高47（二）PCR的反應過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/（二）PCR的反應過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3485引物15引物2第二次復制第一次復制555555模板DNA5555555525～30次循環(huán)（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。5引物15引物2第二次復制第一次復制555549DNA母鏈：解旋酶(條件）：4種脫氧核苷酸：DNA聚合酶（條件）：ATP：引物：緩沖溶液適宜溫度（三）PCR反應的條件80—100℃：耐熱的DNA聚合酶DNA母鏈：（三）PCR反應的條件80—100℃：耐熱的50三、PCR實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5mL3、微量移液器用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質上是能夠自動調控溫度的儀器三、PCR實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具2、微量離心5152多聚酶鏈式反應擴增DNA片段匯總課件524、離心機一種通過高速轉動產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的設備。4、離心機一種通過高速轉動產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的53（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序（反應）循環(huán)數(shù)變性復性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步驟：（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）循環(huán)數(shù)變性復性延54四、結果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照調零→測定→計算50倍蒸餾水做對照波長260nm處讀數(shù)四、結果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照55（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、a條DNA，復制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條D56光吸收波長／nm2602402202800.10.2光吸收波長／nm2602402202800.10.2572、過程①稀釋2μL

PCR反應液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)2、過程①稀釋2μLPCR反應液，加入98μL蒸餾水，即5850：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA的含量為50g/mL紫外分光光度計比色杯50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA的含量為59體內DNA復制與PCR的技術區(qū)別：體內復制PCR技術解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部