重組基因醫(yī)學(xué)知識講座培訓(xùn)課件

重組基因醫(yī)學(xué)知識講座基因重組(geneticrecombination)

是指在體外用酶學(xué)方法將不同來源的DNA進行切割、連接，組成一個新的DNA分子的過程，又稱DNA重組?；蚩寺?genecloning)

將重組DNA分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其擴增和繁殖，以獲得大量的同一DNA分子，稱此為基因克隆、DNA克隆或分子克隆?；蚬こ?geneticengineering)

是將不同來源的DNA片段與載體分子連接形成重組DNA分子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)進行表達，也稱重組DNA技術(shù)。2重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

本章主要內(nèi)容重要的工具酶基因克隆常用的載體重組DNA基本原理重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用3重組基因醫(yī)學(xué)知識講座第一節(jié)重要的工具酶工具酶

基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、逆轉(zhuǎn)錄等相關(guān)的各種酶類。4重組基因醫(yī)學(xué)知識講座一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識別雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中的特異堿基序列，并在特定的位點進行切割的內(nèi)切酶，簡稱限制酶。

根據(jù)限制酶作用特性，一般分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。命名：HindIII屬種株同一株具不同特異性酶5重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

限制酶（Ⅱ型）識別及切割位點特異識別及切割47個bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產(chǎn)生3種末端結(jié)構(gòu)：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或鈍端

回文序列(palindrome)是指該部位的核苷酸序列呈180O反向重復(fù);

粘性末端(stickyend)是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的堿基序列相互間具有互補性。6重組基因醫(yī)學(xué)知識講座⑴產(chǎn)生5'-粘性末端

⑵產(chǎn)生3'-粘性末端7重組基因醫(yī)學(xué)知識講座⑶產(chǎn)生平(頭末)端/鈍端8重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

常用限制性核酸內(nèi)切酶的特性微生物名稱酶名稱識別順序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢桿菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢桿菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大腸桿菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普羅威登細(xì)菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色鏈球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ9重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用

通過切割不同來源DNA雙鏈的特異堿基序列，產(chǎn)生含有黏性末端或平端的、長度不同的DNA片段。用于DNA重組、制備探針、分子雜交、DNA序列分析等。10重組基因醫(yī)學(xué)知識講座重要的工具酶工具酶活性限制性核酸內(nèi)切酶識別特異堿基序列，切割DNAT4DNA連接酶催化DNA5ˊ-磷酸與3ˊ-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA堿性磷酸酶切除5－末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化3'-端合成同聚尾11重組基因醫(yī)學(xué)知識講座第二節(jié)基因克隆常用的載體載體(vector)是指能在連接酶作用下和外源DNA片段連接起來，并運送到宿主細(xì)胞的運載工具。其化學(xué)本質(zhì)為DNA分子。

本節(jié)主要內(nèi)容

載體必須具備的基本條件載體的分類常用的載體12重組基因醫(yī)學(xué)知識講座一、載體必須具備的基本條件⒈具有獨立復(fù)制能力⒉具備多個限制酶的識別位點(多克隆位點)⒊具有遺傳表型或篩選標(biāo)記⒋有足夠的容量以容納外源DNA片段⒌可導(dǎo)入受體細(xì)胞。13重組基因醫(yī)學(xué)知識講座二、載體的分類*（一）克隆載體

用來克隆和擴增DNA片段的載體。

有質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和病毒DNA三類。（二）表達型載體為了使插入的外源DNA能夠表達為多肽鏈而設(shè)計的載體稱為表達型載體。表達型載體除需載體必備條件外，還需相應(yīng)的啟動子、核糖體結(jié)合位點、增強子、終止子等表達調(diào)控構(gòu)件。14重組基因醫(yī)學(xué)知識講座三、常用的載體

（一）質(zhì)粒(plasmid)：

是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點：1.分子量相對較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)，有較高的拷貝數(shù)；2.具有1個以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選；3.具有多克隆位點。

15重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量較小、高拷貝的“松弛型”質(zhì)粒，且具有一個以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點的質(zhì)粒。廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒：

pBR32質(zhì)粒、pUC系列等16重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

pBR322質(zhì)粒①4363bp②含一個復(fù)制點含一個抗氨卞青霉素基因(ampR)④一個抗四環(huán)素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點，供外源基因插入當(dāng)外源基因插入抗藥基因內(nèi)后，抗藥基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).17重組基因醫(yī)學(xué)知識講座pUC系列質(zhì)粒

由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；（1）2674bp；（2）有ampR和與M13噬菌體相同的多克隆位點（MCS）（3）有1個來自E.coli的LacZ基因片斷,編碼半乳糖苷酶，便于藍白篩選18重組基因醫(yī)學(xué)知識講座(二)λ噬菌體組成特點：雙鏈線狀DNA分子，全長50kb，含66個基因，在其分子兩端各含有12個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點。19重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖）20重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

λ噬菌體感染細(xì)菌后的兩種生長途徑

溶菌性生長噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2個COS位點互補成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。

溶源性生長噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解。21重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

第三節(jié)重組DNA基本原理（DNA重組基本程序包括下列過程）

分—獲取目的基因和載體接—目的基因與載體的連接轉(zhuǎn)—重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩—重組DNA的篩選與鑒定22重組基因醫(yī)學(xué)知識講座一、目的基因的獲?。ǚ郑┠康幕蚴侵杆芯炕驊?yīng)用的基因，也是需要克隆或表達的基因。

目的基因來源

1）制備基因組DNA2）制備cDNA3）聚合酶鏈反應(yīng)4）人工合成基因23重組基因醫(yī)學(xué)知識講座（一）制備基因組DNA（基因文庫，genomiclibrary

）分離、純化基因組DNA

在EDTA等存在下，用蛋白

↓RE酶K消化細(xì)胞、酚抽提；大小不同酶切片段

常用蔗糖梯度離心或電泳

↓

分離酶切片斷；分別與同樣RE酶切的載體連接常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體

↓DNA連接酶連接；

導(dǎo)入宿主細(xì)胞、擴增導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)、擴增；

↓得到分子克隆混合體用分子雜交等方法進行鑒定、（基因文庫）篩選、再擴增，分離、回收。24重組基因醫(yī)學(xué)知識講座（二）制備cDNA（cDNA文庫）

分離目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA單鏈水解去除mRNA，合成cDNA雙鏈水解回折處單鏈得到平端雙鏈cDNA與載體連接，導(dǎo)入宿主細(xì)胞擴增→構(gòu)建cDNA文庫。25重組基因醫(yī)學(xué)知識講座（三）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

在體外，以目的基因為模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNAPol等存在下，構(gòu)成一個反應(yīng)體系。經(jīng)94℃變性、54℃退火及72℃延伸3個步驟的反復(fù)多次循環(huán)（2530次），擴增目的基因.

（四）人工合成基因

應(yīng)用DNA測序儀測出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸組成反推核苷酸序列，再用DNA合成儀通過化學(xué)合成原理合成目的基因。（一般先合成短片斷DNA，然后再拼接成長片段）26重組基因醫(yī)學(xué)知識講座二、目的基因與載體的連接（接）

（主要有以下4種連接方式）1)粘性末端連接2）平頭末端連接3）人工接頭法4）同源多聚尾連接法27重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

（一）粘性末端連接

將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再通過DNA連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組DNA分子。

（二）平頭末端連接

有些限制酶只能將目的基因和載體DNA切割成平端，此時在T4DNA連接酶的作用下同樣能連接起來。28重組基因醫(yī)學(xué)知識講座（三）人工接頭法合成連接子→與DNA平頭末端連接→限制酶切割,產(chǎn)生粘性末端→連接，構(gòu)建重組DNA。29重組基因醫(yī)學(xué)知識講座（四）同源多聚尾連接法30重組基因醫(yī)學(xué)知識講座三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)）

無性繁殖

體外重組后的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，然后隨受體細(xì)胞生長、增殖，使重組DNA發(fā)生復(fù)制、擴增，這一過程稱為無性繁殖?？寺?/p>

從上述無性繁殖細(xì)胞中進一步篩選出含目的DNA的重組體分子即為無性繁殖系或克隆。宿主細(xì)胞進行無性繁殖時所采用的受體細(xì)胞.31重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)化

以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；轉(zhuǎn)染

以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；轉(zhuǎn)導(dǎo)

以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。

感受態(tài)細(xì)胞

用特殊方法處理（CaCL2）后，受體細(xì)胞才具備接受外源DNA的能力，這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。32重組基因醫(yī)學(xué)知識講座四、重組DNA的篩選與鑒定（篩）（篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法）

1）平板篩選2）限制酶切圖譜篩選3）PCR篩選重組體4）原位雜交技術(shù)插入失活藍－白篩選33重組基因醫(yī)學(xué)知識講座（一）平板篩選

是指利用載體的遺傳性標(biāo)記在平板上直接篩選的方法。具有抗藥性標(biāo)記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培養(yǎng)平板上生長；未轉(zhuǎn)化的則不能生長。插入失活

當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。34重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

抗生素平板篩選（插入失活）35重組基因醫(yī)學(xué)知識講座2.藍-白篩選

利用藍色化合物的形成作為指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌。載體：編碼β-半乳糖宿主：編碼β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列α-互補細(xì)菌表達：β-半乳糖苷酶活性↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成藍色菌落

當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能與宿主β-半乳糖苷酶的C端進行α-互補→產(chǎn)生白色菌落。

（IPTG存在下）

36重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

藍－白篩選示意圖37重組基因醫(yī)學(xué)知識講座(二)限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定38重組基因醫(yī)學(xué)知識講座（三）PCR篩選重組體

抽提少量重組DNA→PCR擴增→電泳鑒定→序列分析。（四）原位雜交技術(shù)39重組基因醫(yī)學(xué)知識講座1、獲取

DNA重組基本過程(小結(jié))40重組基因醫(yī)學(xué)知識講座2、重組41重組基因醫(yī)學(xué)知識講座3、轉(zhuǎn)化體42重組基因醫(yī)學(xué)知識講座4、篩選43重組基因醫(yī)學(xué)知識講座6、表達表達產(chǎn)物分離純化45重組基因醫(yī)學(xué)知識講座五、重組體在宿主細(xì)胞中的表達和調(diào)控

基因工程的最終目的是通過載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中高效表達，產(chǎn)生有重要價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

克隆基因表達有三個條件

⑴基因的編碼區(qū)不能被插入序列中斷;

⑵基因轉(zhuǎn)錄要有啟動子，而啟動子必須能被宿主

細(xì)胞的RNA聚合酶有效地識別;

⑶mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外

源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解。46重組基因醫(yī)學(xué)知識講座第四節(jié)重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用

一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)

1990年美國科學(xué)家率先啟動人類基因組計劃（HGP），計劃歷時15年，至2005年完成；

2001年2月12日由Since和Nature雜志同時向世界宣布，人類基因組3X109bp的最新圖譜，約含34萬個基因；整個人類基因組的全部核苷酸序列不久即將完成。但要揭示人類4萬個基因功能的任務(wù)將更為艱巨。47重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

人類基因組圖譜的初步完成，不僅為全部基因的定位建立了一個開放框架，而且為分離、鑒定人類疾病相關(guān)基因提供了參照模板。如已知人類遺傳性疾病約有3000種，推測可能是由于某些基因結(jié)構(gòu)異?；蚧蛭灰频韧蛔兯?。如果利用分子生物學(xué)技術(shù)，將患者疾病基因與正?；驁D譜作對照分析，必將有助于闡明遺傳病的分子機制，這對遺傳病的基因治療將起到不可估量的推動作用。48重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

產(chǎn)品名稱治療功能與醫(yī)藥范圍

1.人胰島素

治療糖尿病2.人生長激素治療侏儒癥，加速創(chuàng)口愈合

3.α干擾素治療癌癥、病毒感染4.β干擾素治療帶狀皰疹，眼結(jié)、角膜炎5.γ干擾素治療癌癥、病毒感染6.人組織纖溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治療急性心肌梗塞7.紅細(xì)胞生成素(Epo)治療腎病性貧血，增加紅細(xì)胞及血色素水平8.超氧化物歧化酶清除超氧化物，治療關(guān)節(jié)炎，緩解心肌壞死

9.凝血因子Ⅷ治療A型血友病

10.乙型肝炎疫苗防治肝炎11.神經(jīng)生長因子維持神經(jīng)元細(xì)胞存活、生長和分化12.腦啡膚鎮(zhèn)痛13.降鈣素治療骨質(zhì)疏松癥二、生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)49重組基因醫(yī)學(xué)知識講座基因工程生產(chǎn)胰島素的原理（示意圖）50重組基因醫(yī)學(xué)知識講座三、制備基因工程疫苗

基因工程疫苗可以幫助解決傳統(tǒng)技術(shù)難以解決的一些特殊的病原體疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫苗（HCV）等；（2）有誘發(fā)致癌或產(chǎn)生免疫病理作用的疫苗，如人T細(xì)胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常規(guī)效果較差的疫苗，如霍亂和痢疾疫苗等（4）制備一些多價疫苗等。51重組基因醫(yī)學(xué)知識講座四、改良物種特性52重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

動物藥廠通過轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)感興趣的基因

↓把YFG放在β—乳球蛋白的啟動子下

↓注入羊卵細(xì)胞→植入借腹懷孕的母羊體內(nèi)

↓YFG在乳腺中表達

↓乳汁中提純YFG蛋白。

53重組基因醫(yī)學(xué)知識講座1.分離體細(xì)胞（先處于“饑餓”的“靜止?fàn)顟B(tài)”）→使“關(guān)閉”的基因全部“打開”。2.植入去核的卵細(xì)胞中→胚胎細(xì)胞3.將胚胎細(xì)胞植入寄養(yǎng)母體內(nèi)。五、動物克隆54重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

六、其他應(yīng)用（略）55重組基因醫(yī)學(xué)知識講座

基因重組和基因工程（課堂練習(xí)）基因工程中常用的限制性內(nèi)切酶是

A.Ⅰ型限制酶B.