第四章-DNA重組和基因轉(zhuǎn)移課件

第四章DNA重組和基因轉(zhuǎn)移第四章DNA重組和基因轉(zhuǎn)移第一節(jié)目的基因與載體的連接一粘末端DNA片段的連接（一）具有相同粘末端的DNA分子之間的連接

使用堿性磷酸酶處理載體DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。第一節(jié)目的基因與載體的連接一粘末端DNA片段的連接（一（二）具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接

用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對載體和外源DNA進行切割后，在它們兩端會產(chǎn)生非互補的突出端，經(jīng)DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。

（二）具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對載體酶切HindIIIEcoRI對基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對載體酶切H二平末端DNA片段的連接1直接用T4連接酶連接二平末端DNA片段的連接1直接用T4連接酶連接2同聚物加尾法2同聚物加尾法3銜接物連接法銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。3銜接物連接法銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個所謂載體與DNA片段酶切位點不匹配，指載體與待克隆的DNA片段上的酶切位點不相同，因而用一種或兩種酶切制造不出可互補的粘性末端。

1按照平末端連接方法加上接頭2將凹端變?yōu)槠蕉耍?）使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3′凹端完全補平。（2）用S1核酸酶去除3′突出末端產(chǎn)生平端DNA分子

三載體與DNA片段酶切位點不匹配的連接所謂載體與DNA片段酶切位點不匹配，指載體與待克隆的DNA片3使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補平3′凹端轉(zhuǎn)變成粘端。載體經(jīng)XhoI酶切形成：外源基因用San3A酶切形成：用Klenow酶部分補平二者的3′凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA這樣，就可以實現(xiàn)有效重組。TCGAAGCT3′3′5′5′GATCCTAG3′3′5′5′3使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補平3′四cDNA與載體的連接通過依次加入、連接合成的DNA接頭進行cDNA克隆四cDNA與載體的連接通過依次加入、連接合成的DNA接頭進第二節(jié)重組DNA分子的篩選與鑒定外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況：（2）（3）（1）轉(zhuǎn)化E.coli第二節(jié)重組DNA分子的篩選與鑒定外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化一遺傳檢測法（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子1抗藥性標記插入失活篩選法例：pBR322如果外源基因插入到tetr基因內(nèi)部，tetr抗性消失，表型為不抗四環(huán)素（tets）、而仍抗氨芐青霉素（ampr），這樣的轉(zhuǎn)化細胞在含有

amp的培養(yǎng)基仍可生長，但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能再生長；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其內(nèi)部而失活，帶有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細胞在含有tet的培養(yǎng)基平板上生長，在含有

amp的培養(yǎng)基不能生長。

一遺傳檢測法（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子1抗藥性例:pUC質(zhì)粒在LacZ—的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。若在該細胞中引入pUC質(zhì)粒，其上有LacZ′，質(zhì)粒和大腸桿菌DNA可實現(xiàn)α—互補，菌落呈藍色。如果在質(zhì)粒的多克隆位點的某個酶切點上克隆了外源基因，則LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。

（二）根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體

進入受體細胞的重組DNA分子中的外源基因如果在宿主細胞中能實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出有功能活性的基因產(chǎn)物，那么鑒定此種重組體最簡便的方法就是表型特征的直接選擇法。

2α—互補例:pUC質(zhì)粒在LacZ—的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)二物理檢測法凝膠電泳檢測法二物理檢測法凝膠電泳檢測法三核酸雜交檢測法

例：原位雜交篩選重組體菌落(或噬菌斑)三核酸雜交檢測法例：原位雜交篩選重組體菌落(或噬菌斑)四免疫化學(xué)檢測法

免疫化學(xué)檢測法是利用抗體與抗原結(jié)合的高度特異性來鑒別基因的。如果某個重組克隆中的外源基因能夠表達，在這個克隆中就存在著這個基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測。常用的有標記抗體測定法和免疫沉淀測定法兩種。標記抗體測定法的步驟：轉(zhuǎn)化菌落影印平板置于含氯仿飽合氣體的容器細菌裂解，抗原釋放覆蓋吸附有未經(jīng)標記的抗體的NC膜形成抗原抗體復(fù)合物將NC膜與I125標記的抗體溫育

放射自顯影與母板對照，挑取所需的重組克隆

四免疫化學(xué)檢測法免疫化學(xué)檢測法是利用抗體與抗原結(jié)合的高度用免疫化學(xué)法檢測克隆在表達載體pUC8上的基因用免疫化學(xué)法檢測克隆在表達載體pUC8上的基因第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移方法一重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌

（一）轉(zhuǎn)化

將外源DNA分子導(dǎo)入某一宿主細菌細胞的過程都叫轉(zhuǎn)化。

為了有效地使細菌吸收外源的DNA分子，我們通常要對它們進行一些物理或化學(xué)的處理，處理后的細胞吸收外源DNA的能力大大提高，被稱為感受態(tài)細胞。對于大腸桿菌細胞，一般采用50mmol/L的CaCl2溶液來制備感受態(tài)細胞。第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移方法一重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化（1）吸附階段：完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細胞表面（2）轉(zhuǎn)入階段：雙鏈DNA分子解鏈，以單鏈形式進入細胞，而另一鏈則被降解

（3）自身穩(wěn)定階段：外源質(zhì)粒在細胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)型DNA（4）表達階段：即目的基因隨質(zhì)粒的復(fù)制子一起復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯

DNA分子轉(zhuǎn)化的過程：質(zhì)粒DNA的大小及構(gòu)型對轉(zhuǎn)化效率的影響：（1）大小＞10Kb，轉(zhuǎn)化效率很低（2）構(gòu)型超螺旋＞環(huán)形＞線狀（1）吸附階段：完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細胞表面D（二）轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)：是指感受態(tài)的受體細胞捕獲和表達以噬菌體為載體的重組DNA分子的過程。

（1）轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的區(qū)別轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞的過程。

轉(zhuǎn)染：λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細胞的過程。體外包裝：是指在體外模擬λ噬菌體DNA在受體細胞內(nèi)的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝成為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。（2）λ噬菌體的體外包裝（二）轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)：是指感受態(tài)的受體（1）基因槍法

80年代末期，由康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細胞，把細胞擊孔，使目的基因進入受體。

首先將鎢、金微粒(直徑約0.4μm，重量約0.05mg)與供體DNA溶液(1～2μl)混合并保溫，使DNA吸附在金屬微粒的表面，然后將該溶液置于所謂的“基因槍”儀器中，儀器高壓放電將金屬微粒加速，直接噴射受體原生質(zhì)或細胞，細胞擊穿成孔后，在鎢粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以進入受體細胞。

操作技術(shù)程序為：（三）DNA直接導(dǎo)入法1物理方法基因槍示意圖（1）基因槍法80年代末期，由康奈爾大學(xué)的Sanford最（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟實惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對植物細胞的毒害也比金粉大。（2）將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動力系統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動力加速微彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動力；第三類以高壓蒸汽作為動力?；驑尫ǖ奶攸c（2）受體廣泛。（3）操作簡單。（1）轉(zhuǎn)化效率高。基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟實惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易電激法是利用高壓電脈沖的作用對原生質(zhì)體或細胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法。

原理：細胞生物學(xué)研究證明，細胞膜的磷脂雙分子層可視為一種電容，其靜膜電位（Vm）約為l00mV，導(dǎo)電性很差。當把細胞置于外加電場中時，會使膜電位升高，雙分子層兩端電壓形成差勢，隨著外加電場電壓升高，細胞膜被壓縮變薄，當膜電壓升到一定數(shù)值時，膜被擊穿。

可逆擊穿：擊穿小孔可在一定時間內(nèi)復(fù)原。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復(fù)，處理細胞成活率低。（2）電激法(electroperation)電激法是利用高壓電脈沖的作用對原生質(zhì)體或細胞擊出微孔而使基因?qū)⑹⒂屑毎虳NA混合物的特制小容器置于電脈沖儀的正負極之間，在0度下加高壓（2～4KV），電脈沖10分鐘后，將待處理的細胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中生長2天，再進行篩選。存活細胞的回收率約為60%～80%。操作程序：將盛有細胞和DNA混合物的特制小容器置于電脈沖儀的正負極之間微量注射：用注射針或微針在受體細胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿刺孔進入細胞或隨穿刺針頭—道進入。

真正的顯微注射：利用顯微注射儀，通過機械方法把外源DNA直接注入細胞質(zhì)或細胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。

常用的細胞固定方法有3種：一瓊脂糖包埋法二多聚賴氨酸粘連法三吸管支持法（3）微注射法（micro-injection）顯微注射技術(shù)的關(guān)鍵是原生質(zhì)體或具壁細胞或細胞團的固定。對于植物細胞而言，首先必須建立固定細胞技術(shù)，然后才能進行定位顯微注射操作。微量注射：用注射針或微針在受體細胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿（5）超聲波法

此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后用激光光源代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細胞周圍的外源DNA分子隨之進入細胞。基本原理：是利用低聲強脈沖超聲波的物理作用，擊穿細胞膜造成通道，使外源DNA進入細胞。

利用超聲波處理可避免脈沖高壓對細胞的損傷作用，有利于原生質(zhì)體的存活，是一種有潛力的轉(zhuǎn)化途徑。（6）離子束法

離了束作用在生物表面后可引起電子濺射，離子束的濺射好象一把手術(shù)刀，對生物體進行微細加工，使生物體表面層層剝離，原來不連通的通道在一定距離內(nèi)連通，后來的離子就可穿行較長的距離，落在預(yù)定的位置上。

（4）激光微束法(lasermicrobeam)（5）超聲波法此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起（1）PEG法

是細胞融合劑，它可以使細胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連；還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，從而有利于細胞膜之間的融合和外源DNA進入原生質(zhì)體。(2)脂質(zhì)體法脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜結(jié)構(gòu)，可將DNA包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源DNA轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。早期：絲氨酸磷酸+膽固醇第二代：二油酰乙醇胺磷脂+膽固醇+軟脂酸2化學(xué)方法（1）PEG法是細胞融合劑，它可以使細胞膜之間或DNA與膜第四章DNA重組和基因轉(zhuǎn)移第四章DNA重組和基因轉(zhuǎn)移第一節(jié)目的基因與載體的連接一粘末端DNA片段的連接（一）具有相同粘末端的DNA分子之間的連接

使用堿性磷酸酶處理載體DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。第一節(jié)目的基因與載體的連接一粘末端DNA片段的連接（一（二）具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接

用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對載體和外源DNA進行切割后，在它們兩端會產(chǎn)生非互補的突出端，經(jīng)DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。

（二）具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對載體酶切HindIIIEcoRI對基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對載體酶切H二平末端DNA片段的連接1直接用T4連接酶連接二平末端DNA片段的連接1直接用T4連接酶連接2同聚物加尾法2同聚物加尾法3銜接物連接法銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。3銜接物連接法銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個所謂載體與DNA片段酶切位點不匹配，指載體與待克隆的DNA片段上的酶切位點不相同，因而用一種或兩種酶切制造不出可互補的粘性末端。

1按照平末端連接方法加上接頭2將凹端變?yōu)槠蕉耍?）使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3′凹端完全補平。（2）用S1核酸酶去除3′突出末端產(chǎn)生平端DNA分子

三載體與DNA片段酶切位點不匹配的連接所謂載體與DNA片段酶切位點不匹配，指載體與待克隆的DNA片3使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補平3′凹端轉(zhuǎn)變成粘端。載體經(jīng)XhoI酶切形成：外源基因用San3A酶切形成：用Klenow酶部分補平二者的3′凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA這樣，就可以實現(xiàn)有效重組。TCGAAGCT3′3′5′5′GATCCTAG3′3′5′5′3使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補平3′四cDNA與載體的連接通過依次加入、連接合成的DNA接頭進行cDNA克隆四cDNA與載體的連接通過依次加入、連接合成的DNA接頭進第二節(jié)重組DNA分子的篩選與鑒定外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況：（2）（3）（1）轉(zhuǎn)化E.coli第二節(jié)重組DNA分子的篩選與鑒定外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化一遺傳檢測法（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子1抗藥性標記插入失活篩選法例：pBR322如果外源基因插入到tetr基因內(nèi)部，tetr抗性消失，表型為不抗四環(huán)素（tets）、而仍抗氨芐青霉素（ampr），這樣的轉(zhuǎn)化細胞在含有

amp的培養(yǎng)基仍可生長，但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能再生長；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其內(nèi)部而失活，帶有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細胞在含有tet的培養(yǎng)基平板上生長，在含有

amp的培養(yǎng)基不能生長。

一遺傳檢測法（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子1抗藥性例:pUC質(zhì)粒在LacZ—的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。若在該細胞中引入pUC質(zhì)粒，其上有LacZ′，質(zhì)粒和大腸桿菌DNA可實現(xiàn)α—互補，菌落呈藍色。如果在質(zhì)粒的多克隆位點的某個酶切點上克隆了外源基因，則LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。

（二）根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體

進入受體細胞的重組DNA分子中的外源基因如果在宿主細胞中能實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出有功能活性的基因產(chǎn)物，那么鑒定此種重組體最簡便的方法就是表型特征的直接選擇法。

2α—互補例:pUC質(zhì)粒在LacZ—的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)二物理檢測法凝膠電泳檢測法二物理檢測法凝膠電泳檢測法三核酸雜交檢測法

例：原位雜交篩選重組體菌落(或噬菌斑)三核酸雜交檢測法例：原位雜交篩選重組體菌落(或噬菌斑)四免疫化學(xué)檢測法

免疫化學(xué)檢測法是利用抗體與抗原結(jié)合的高度特異性來鑒別基因的。如果某個重組克隆中的外源基因能夠表達，在這個克隆中就存在著這個基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測。常用的有標記抗體測定法和免疫沉淀測定法兩種。標記抗體測定法的步驟：轉(zhuǎn)化菌落影印平板置于含氯仿飽合氣體的容器細菌裂解，抗原釋放覆蓋吸附有未經(jīng)標記的抗體的NC膜形成抗原抗體復(fù)合物將NC膜與I125標記的抗體溫育

放射自顯影與母板對照，挑取所需的重組克隆

四免疫化學(xué)檢測法免疫化學(xué)檢測法是利用抗體與抗原結(jié)合的高度用免疫化學(xué)法檢測克隆在表達載體pUC8上的基因用免疫化學(xué)法檢測克隆在表達載體pUC8上的基因第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移方法一重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌

（一）轉(zhuǎn)化

將外源DNA分子導(dǎo)入某一宿主細菌細胞的過程都叫轉(zhuǎn)化。

為了有效地使細菌吸收外源的DNA分子，我們通常要對它們進行一些物理或化學(xué)的處理，處理后的細胞吸收外源DNA的能力大大提高，被稱為感受態(tài)細胞。對于大腸桿菌細胞，一般采用50mmol/L的CaCl2溶液來制備感受態(tài)細胞。第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移方法一重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化（1）吸附階段：完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細胞表面（2）轉(zhuǎn)入階段：雙鏈DNA分子解鏈，以單鏈形式進入細胞，而另一鏈則被降解

（3）自身穩(wěn)定階段：外源質(zhì)粒在細胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)型DNA（4）表達階段：即目的基因隨質(zhì)粒的復(fù)制子一起復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯

DNA分子轉(zhuǎn)化的過程：質(zhì)粒DNA的大小及構(gòu)型對轉(zhuǎn)化效率的影響：（1）大?。?0Kb，轉(zhuǎn)化效率很低（2）構(gòu)型超螺旋＞環(huán)形＞線狀（1）吸附階段：完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細胞表面D（二）轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)：是指感受態(tài)的受體細胞捕獲和表達以噬菌體為載體的重組DNA分子的過程。

（1）轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的區(qū)別轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞的過程。

轉(zhuǎn)染：λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細胞的過程。體外包裝：是指在體外模擬λ噬菌體DNA在受體細胞內(nèi)的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝成為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。（2）λ噬菌體的體外包裝（二）轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)：是指感受態(tài)的受體（1）基因槍法

80年代末期，由康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細胞，把細胞擊孔，使目的基因進入受體。

首先將鎢、金微粒(直徑約0.4μm，重量約0.05mg)與供體DNA溶液(1～2μl)混合并保溫，使DNA吸附在金屬微粒的表面，然后將該溶液置于所謂的“基因槍”儀器中，儀器高壓放電將金屬微粒加速，直接噴射受體原生質(zhì)或細胞，細胞擊穿成孔后，在鎢粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以進入受體細胞。

操作技術(shù)程序為：（三）DNA直接導(dǎo)入法1物理方法基因槍示意圖（1）基因槍法80年代末期，由康奈爾大學(xué)的Sanford最（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟實惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對植物細胞的毒害也比金粉大。（2）將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動力系統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動力加速微彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動力；第三類以高壓蒸汽作為動力?；驑尫ǖ奶攸c（2）受體廣泛。（3）操作簡單。（1）轉(zhuǎn)化效率高?；驑屗貌牧希海?）鎢粉使用起來經(jīng)濟實惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易電激法是利用高壓電脈沖的作用對原生質(zhì)體或細胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法。

原理：細胞生物學(xué)研究證明，細胞膜的磷脂雙分子層可視為一種電容，其靜膜電位（Vm）約為l00mV，導(dǎo)電性很差。當把細胞置于外加電場中時，會使膜電位升高，雙分子層兩端電壓形成差勢，隨著外加電場電壓升高，細胞膜被壓縮變薄，當膜電壓升到一定數(shù)值時，膜被擊穿。

可逆擊穿：擊穿小孔可在一定時間內(nèi)復(fù)原。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復(fù)，處理細胞成活率低。（2）電激法(electroperation)電激法是利用高壓電脈沖的作用對原生質(zhì)體或細胞擊出微孔而使基因?qū)⑹⒂屑毎虳NA混合物的特制小容器置于電脈沖儀的正負極之間，在0度下加高壓（2～4KV），電脈沖10分鐘后，將待處理的細胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中生長2天，再進行篩選。存活細胞的回收率約