免疫抑制小鼠灌服蠐螬多肽的療效分析,免疫學(xué)論文

免疫抑制小鼠灌服蠐螬多肽的療效分析,免疫學(xué)論文摘要：目的觀察蠐螬多肽提取物對免疫抑制小鼠的免疫功能的影響。方式方法采取蛋白酶水解提取蠐螬多肽,電泳確定相對分子質(zhì)量大小,然后天天給小鼠灌服不同劑量多肽連續(xù)20d,除對照組外其余小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前連續(xù)3d腹腔注射環(huán)磷酰胺,試驗(yàn)結(jié)束小鼠稱體質(zhì)量、采血、無菌操作制備脾臟細(xì)胞,體外培養(yǎng)添加脂多糖和刀豆蛋白A誘導(dǎo)細(xì)胞分化,采用MTT和Griess法檢測細(xì)胞增殖率和NO分泌量;分光光度法和流式技術(shù)檢測血清溶血素及巨噬細(xì)胞吞噬功能,遲發(fā)型超敏反響分析免疫原性。結(jié)果酶解提取蠐螬多肽質(zhì)量濃度為37.01mg/ml,提取率為31.63%,Mr在8000～9000。模型組小鼠脾臟肝臟胸腺指數(shù)顯著低于對照組和蠐螬組,小鼠脾臟和骨髓T、B淋巴細(xì)胞存活率及NO分泌量明顯低于對照組和蠐螬組,華而不實(shí)骨髓B淋巴細(xì)胞存活率顯著高于T淋巴細(xì)胞,但脾臟和骨髓T淋巴細(xì)胞NO分泌量高于B淋巴細(xì)胞;對照組和蠐螬多肽組小鼠溶血素吸光度值顯著高于模型組,隨著蠐螬多肽劑量增加溶血素含量逐步提高,但不存在劑量效應(yīng)關(guān)系;蠐螬組小鼠血液白細(xì)胞數(shù)均高于模型組,隨著劑量增加白細(xì)胞數(shù)提高;中高劑量蠐螬多肽組小鼠耳腫脹度高于模型組,隨著蠐螬劑量增加耳腫脹度顯著增加,存在劑量效應(yīng)關(guān)系;蠐螬組小鼠腹腔骨髓脾臟巨噬吸光度值高于模型組,隨著蠐螬多肽劑量增加吸光度值提高,存在劑量效應(yīng)關(guān)系;流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果蠐螬組巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)于模型組,巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)不明顯高于模型組,結(jié)果提示巨噬細(xì)胞吞噬能力強(qiáng)。結(jié)論蠐螬多肽具有明顯加強(qiáng)免疫抑制小鼠免疫功能的作用。本文關(guān)鍵詞語：蠐螬多肽;小鼠;免疫功能;Abstract：Thisstudywasperformedtoinvestigatetheeffectsofpolypeptideextractsfromgrubonimmunefunctionofimmunosuppressivemice.Thegrubpolypeptides(GP)wereextractedbyproteasemethod,andthesizeofthemoleculewasdeterminedbyelectrophoresis.Thenthemiceweregivenorallydifferentdosesofgrubpeptidesfor20days.Allmiceexceptthemiceincontrolgroupwereintraperitoneallyinjectedwithcyclophosphamide(CTX)for3daysbeforetheendoftheexperiment.Themicewerepreparedbyweighing,collectingbloodandasepticoperationforspleencells.Thecelldifferentiationwasinducedbylipopolysaccharide(LPS)andconcanavalinA(ConA),andcellproliferationandNOlevelweredetectedbyMTTandGriessmethod.Theserumhaemolysinandmacrophagephagocytosiswereevaluatedbyspectrophotometryandflowcytometry,whiletheimmunogenicitywasanalyzedbydelayedhypersensitivity.Datashowedthattheconcentrationofpolypeptideextractedbyenzymolysiswas31.63%andtheextractionratewas37.01mg/ml,withmolecularweightof8to9KDa.Thespleenandliverthymusindexesofmiceinmodelgroupweresignificantlylowerthanthoseofthecontrolandthegrubgroups.ThesurvivalrateofspleneticandmyeloidTandBlymphocytesandthesecretionofNOinmodelmiceweresignificantlylowerthanthoseofthecontrolandthegrubgroups.ThesurvivalrateofBlymphocytefrombonemarrowwassignificantlyhigherthanthatofTlymphocyte,butthesecretionofNOinthespleenandbonemarrowTlymphocytewashigherthanthatofBlymphocyte.Theabsorbanceofhaemolysinincontrolgroupandgrubpolypeptidegroupweresignificantlyhigherthanthatinmodelgroup.Withtheincreasingofgrubpolypeptidedose,thecontentofhemolysinincreasedgradually,buttherewasnodoseeffectrelationship.Thenumberofwhitebloodcellsingrubgroupswashigherthanthatinmodelgroup.Theearswellingofthemiceinmediumandhighdosegrubpolypeptidegroupswerehigherthanthatofmodelgroup.Withtheincreasingofgrubdose,theearswellingthicknessincreasedsignificantly,andtherewasadoseeffectrelationship.Theabsorbancevaluesofthemacrophagesfromabdominalcavityandbonemarrowaswellasspleenofgrubgroupwerehigherthanthoseofmodelgroup,andtherewasadoseeffectrelationship.Thefluorescenceintensityofmacrophagephagocytosisingrubgroupwasstrongerthanthatofmodelgroup,andthenumberofpositivecellsofmacrophagesphagocytingredcellwasnotsignificantlyhigherthanthatofmodelgroup,whichsuggestedthatthemacrophagephagocytosiswasstrong.Takentogether,polypeptidesfromgrubcansignificantlyenhanceimmunefunctioninimmunosuppressedmice.Keyword：Grubpolypeptide;Mice;Immunefunction;蠐螬為金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子及同屬近緣昆蟲的枯燥幼蟲,在江蘇、安徽、山東和東北等地均有分布[1],神農(nóng)本草經(jīng)記載其具有破瘀、止痛和解毒的作用。文獻(xiàn)報(bào)道,蠐螬主要含有脂肪酸類、蛋白質(zhì)、糖類、生物堿和甾體化合物等[2,3]。金哲等[4]發(fā)現(xiàn)蠐螬聯(lián)用羥基喜樹堿對人MGC-803胃癌細(xì)胞株有顯著性抗增殖作用,陳梅等[5]發(fā)現(xiàn)蠐螬提取物能抑制家兔脈絡(luò)膜新生血管中的血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子表示出,抑制脈絡(luò)膜新生血管的構(gòu)成。多肽是20種氨基酸以不同的的組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性或環(huán)形構(gòu)造的具有不同生物活性肽類的總稱[6],由于多肽構(gòu)造樣式繁多,其在人體生理和代謝上表現(xiàn)出多種藥理活性,主要有提高免疫力、降血糖和抗氧化等功能。嚴(yán)銘銘等[7]分離得到了單一鹿茸多肽CNT14,其能夠明顯促進(jìn)小鼠海馬HT22細(xì)胞增殖。本研究擬從蠐螬中提取蠐螬多肽,通過體內(nèi)試驗(yàn)分析其免疫調(diào)節(jié)作用,為蠐螬的開發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)根據(jù)。1、材料與方式方法1.1、實(shí)驗(yàn)材料環(huán)磷酰胺(CTX)購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司,RPMI1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司,刀豆蛋白(ConA)和脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司,噻唑藍(lán)(MTT)購自美國AMRESCO公司,羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)購自北京化工廠,蠐螬多肽(GP)由本實(shí)驗(yàn)室制備。細(xì)胞培養(yǎng)板和酶標(biāo)板購自美國Corning公司,二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO產(chǎn)品,XSZ-D2倒置生物顯微鏡為重慶光學(xué)儀器廠產(chǎn)品,粉碎機(jī)(小型)購于日本日立公司。6～8周齡健康昆明小鼠,體質(zhì)量20～22g,購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK-(京)2021-0002】。1.2、蠐螬多肽的提取純化及鑒定1.2.1、提取取5g蠐螬粉于含100ml蒸餾水的燒杯中并調(diào)pH至8.0,向其參加木瓜蛋白酶攪拌,置于55℃水浴鍋水浴2.5h,然后置于100℃沸水10min終止酶解反響,10000r/min離心15min,收集上清為蠐螬多肽粗提取物;粗提取物與10%三氯乙酸1.25ml搖勻,靜置10min,4000r/min離心15min,取3ml上清液參加2ml雙縮脲試劑混勻,靜置10min后2000r/min離心10min,取上清于540nm處測吸光度值,同時(shí)制作谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算蠐螬多肽質(zhì)量濃度及提取率。1.2.2、純化采用Mr10000膜超濾粗提物得Mr10000和Mr10000多肽,然后用10ml玻璃分離柱,0.02mol/L的Tiris-HCl作為緩沖液,0.5mol/L的NaCl做梯度洗脫,洗脫流速1ml/min,上樣質(zhì)量濃度25mg/ml的上樣量1～2ml進(jìn)行離子層析,按洗脫峰收集分離純化Mr10000的蠐螬多肽,備用。1.2.3、鑒定采用Tricine-SDS法鑒定蠐螬多肽相對分子質(zhì)量,首先按4∶1取蠐螬多肽和5loadingBuffer混合,沸水浴10min,冷至室溫備用;然后根據(jù)凝膠配方制膠;其次灌膠:取制膠架、1.5mm制膠板、制膠夾和電泳槽一套,組裝并檢查能否漏膠,用加樣槍緩緩注膠于裝置內(nèi),加樣后用去離子水壓平界面,靜置等待分層,同理參加濃縮膠,插入10孔梳子,準(zhǔn)備電泳;最后點(diǎn)樣:裝備好電泳設(shè)備后槽中參加電泳液,依次加點(diǎn)樣蛋白Marker5?l和樣品30?l。1.3、動(dòng)物分組與給藥處理取50只健康昆明小鼠隨機(jī)分對照組、模型組(環(huán)磷酰胺組)、蠐螬多肽組;蠐螬組小鼠天天1次灌服不同劑量蠐螬多肽(50、100、200mg/kg),對照組和模型組灌服等量生理鹽水,連續(xù)灌服20d,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3d,除對照組外其余小鼠天天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CY)50mg/kg,連續(xù)3d。1.4、小鼠白細(xì)胞數(shù)與臟器指數(shù)的測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束小鼠稱體質(zhì)量,取全血于抗凝管中,采用全血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞數(shù);頸椎脫臼處死小鼠,摘取脾臟、肝臟、腎臟,生理鹽水清洗,濾紙吸干后稱質(zhì)量,根據(jù)公式計(jì)算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。1.5、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反響(DTH)檢測末次給藥后小鼠腹部剃毛,均勻涂抹50?l二甲苯致敏,4d后在小鼠右耳均勻涂抹20?l二甲苯,24h后將小鼠頸椎脫臼處死,用直徑為8mm打孔器在左右耳一樣位置取下圓耳片稱質(zhì)量,記錄致敏前后質(zhì)量之差即為其耳脹程度。1.6、小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞制備處死小鼠無菌操作取脾于200目細(xì)胞篩研碎,收集細(xì)胞懸液,3000r/min離心4min,棄上清PBS懸浮細(xì)胞,加紅細(xì)胞裂解液1～2min,3000r/min離心4min,棄上清反復(fù)洗,培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,參加細(xì)胞培養(yǎng)皿37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4h,收集未貼壁懸浮細(xì)胞,3000r/min離心4min,棄上清加完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1106/ml;同樣方式方法收集貼壁細(xì)胞,制備脾臟巨噬細(xì)胞;無菌操作取脛骨和股骨,收集骨髓細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)皿,同理脾細(xì)胞制備一樣,制備骨髓淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞備用(運(yùn)晨霞等)[8]。1.7、小鼠淋巴細(xì)胞增殖檢測取100?l脾細(xì)胞(或骨髓細(xì)胞)和100?l完全培養(yǎng)基參加96孔細(xì)胞板,T淋巴細(xì)胞組每孔加5?l100?g/mlConA,B淋巴細(xì)胞組每孔加2?l1mg/mlLPS,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,然后每孔參加8?l5mg/mlMTT繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄上清每孔加150?lDMSO,振蕩10min酶標(biāo)儀570nm測OD值,計(jì)算細(xì)胞增殖率%=處理組吸光度值/對照組吸光度值100%1.8、小鼠淋巴細(xì)胞分泌NO檢測汲取細(xì)胞上清100?l至酶標(biāo)板中,每孔參加等量Griess試劑,室溫反響10min,置于490nm測吸光值,根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算細(xì)胞分泌NO量。1.9、染色法檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能取100?l巨噬細(xì)胞懸液參加96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,棄上清,每孔各加0.075%的中性紅100?l,繼續(xù)培養(yǎng)3h,棄去中性紅,用PBS洗2次,加細(xì)胞裂解劑(醋酸∶無水乙醇=1∶1V/V),酶標(biāo)儀540nm測吸光度值。1.10、流式細(xì)胞技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞的吞噬能力1.10.1、CFSE標(biāo)記雞紅細(xì)胞[9]取雞靜脈采血,制備新鮮雞紅細(xì)胞(cRBC),參加PBS稀釋,1600r/min離心5min,棄上清,PBS重復(fù)洗2次,用RPMI1640培養(yǎng)液將雞紅細(xì)胞數(shù)調(diào)為4107/ml,參加10mmol/L的CFSE使其終濃度為5?mol/L,37℃培養(yǎng)箱恒溫孵育15min,取出加培養(yǎng)液終止反響,1600r/min離心5min,棄上清,培養(yǎng)液洗2次,懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù),將CFSE-cRBC細(xì)胞數(shù)調(diào)為2106/ml,以備用。1.10.2、CFSE標(biāo)記雞紅細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共孵育[10]將收集的巨噬細(xì)胞參加24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～4h,取出棄上清加無菌PBS沖洗2次,向細(xì)胞培養(yǎng)板各孔加2106/mlCFSE-cRBC細(xì)胞液1ml,然后將其置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育2～4h。1.10.3、流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞的吞噬能力[11]收集共同孵育的巨噬細(xì)胞和雞紅細(xì)胞于離心管,1600r/min離心5min,棄上清,參加緩沖液重懸細(xì)胞并將細(xì)胞數(shù)調(diào)為4106/ml,分別取各組100?l細(xì)胞懸液于流式管,上流式細(xì)胞儀檢測。1.11、血清溶血素含量測定結(jié)束前7d小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.2ml,末次給藥24h后,采血制備血清,生理鹽水100倍稀釋血清,取稀釋血清1ml與5%雞紅細(xì)胞懸液0.5ml以及10%豚鼠補(bǔ)體1ml混合,37℃溫育30min,0℃終止反響,離心取上清,置于紫外分光光度計(jì)540nm測OD值。1.12、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn)分析,P0.05以為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1、蠐螬多肽的提取純化與鑒定采用酶解法制備蠐螬多肽,華而不實(shí)料液比1∶20、加酶量和酶解的時(shí)間分別為6000U和2.5h,利用谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線測得蠐螬多肽粗提取物質(zhì)量濃度為37.01mg/ml,提取率為31.63%;通過超濾和離子層析得2個(gè)組分蠐螬多肽(圖1),收集高峰洗脫出來多肽,采用TricineSDS鑒定蠐螬多肽分子大小,結(jié)果觀察電泳圖,根據(jù)Marker蛋白相對分子質(zhì)量比照,提取的蠐螬多肽分子為相對分子質(zhì)量8000～9000的小肽(圖2)。2.2、蠐螬多肽對小鼠臟器指數(shù)的影響根據(jù)小鼠體質(zhì)量和臟器質(zhì)量比擬,結(jié)果小鼠臟器指數(shù)見表1。由表1知,模型組小鼠脾臟肝臟胸腺指數(shù)顯著低于對照組,而蠐螬組小鼠脾臟肝臟胸腺指數(shù)提高,且顯著高于模型組,隨著蠐螬多肽劑量增加,華而不實(shí)脾臟指數(shù)逐步提高,存在著劑量效應(yīng)關(guān)系。圖1蠐螬多肽提取物離子層析純化圖Fig1Ionchromatographypurificationofpolypeptidesextractsfromthegrub圖2Tricine-SDS分析蠐螬多肽分子大小Fig2Tricine-SDSanalysisforthemoleculesizeofgrubpolypeptides2.3、蠐螬多肽對免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖和分泌NO的影響采用MTT法對免疫抑制小鼠不同組織淋巴細(xì)胞增殖分析,結(jié)果模型組小鼠T、B淋巴細(xì)胞存活率明顯低于對照組,蠐螬組脾臟和骨髓T、B淋巴細(xì)胞存活率高于模型組,華而不實(shí)脾臟B淋巴細(xì)胞存活率顯著增加,而且高于脾臟T淋巴細(xì)胞(圖3a);蠐螬組骨髓T淋巴細(xì)胞存活率為81.48%5.23%,B淋巴細(xì)胞存活率為95.27%5.56%,骨髓B淋巴細(xì)胞存活率顯著高于T淋巴細(xì)胞(圖3b)。表1蠐螬多肽對免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響a)P0.05,b)P0.01,vscontrolgroup;c)P0.01,vsmodelgroup.采用Griess法分析淋巴細(xì)胞分泌NO情況,結(jié)果模型組小鼠脾臟和骨髓T、B淋巴細(xì)胞NO分泌量明顯低于對照組,蠐螬組T、B淋巴細(xì)胞NO分泌量較模型組明顯增加,隨蠐螬多肽劑量增加淋巴細(xì)胞分泌NO量逐步提高,存在劑量依靠關(guān)系(圖4),華而不實(shí)脾臟T淋巴細(xì)胞NO量到達(dá)(1.330.11)mmol/L,而B淋巴細(xì)胞高達(dá)(1.260.08)mmol/L(圖4a),骨髓T淋巴細(xì)胞NO濃度到達(dá)(1.550.05)mmol/L,B淋巴細(xì)胞高達(dá)(1.340.13)mmol/L(圖4b),脾臟和骨髓T淋巴細(xì)胞分泌NO量高于B淋巴細(xì)胞。圖3蠐螬多肽對免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig3Effectsofgrubpolypeptidesontheproliferationoflymphocytesinimmunosuppressivemicea)Splen;b)bonemarrow.**P0.01,vscontrolgroup;△P0.05,vsmodelgroup.圖4蠐螬多肽對免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞NO分泌的影響Fig4EffectsofgrubpolypeptidesonNOsecretionfromlymphocytesofimmunosuppressivemicea)Splen;b)bonemarrow.**P0.01,vscontrolgroup;△P0.05,△△P0.01,vsmodelgroup.2.4、蠐螬多肽對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響采用分光光度法分析巨噬細(xì)胞吞噬功能,結(jié)果模型組腹腔脾臟骨髓巨噬細(xì)胞吸光度值顯著低于對照組,蠐螬組小鼠腹腔骨髓脾臟巨噬吸光度值高于模型組,隨著蠐螬多肽劑量增加吸光度值提高,存在劑量效應(yīng)關(guān)系(圖5);3種組織巨噬細(xì)胞之間比擬,腹腔和脾臟巨噬細(xì)胞吸光度值高于骨髓巨噬細(xì)胞。采用流式細(xì)胞技術(shù)分析腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力,結(jié)果蠐螬組巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)于模型組,巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)不明顯高于模型組,結(jié)果提示巨噬細(xì)胞吞噬能力加強(qiáng)了(圖6)。圖5分光光度法分析蠐螬多肽對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Fig5Effectsofgrubpolypeptidesonthephagocytosisofmacrophagesfromimmunosuppressivemicedetectedbyspectrophotometry**P0.01,vscontrolgroup;△P0.05,△△P0.01,vsmodelgroup.2.5、蠐螬多肽對免疫抑制小鼠白細(xì)胞數(shù)和溶血素的影響采用分光光法檢測小鼠血清溶血素含量,結(jié)果對照組和蠐螬多肽組小鼠溶血吸光度值顯著高于模型組組,隨著蠐螬多肽劑量增加小鼠血清溶血素含量逐步提高,但不存在劑量效應(yīng)關(guān)系。采用血細(xì)胞分析儀檢測小鼠血液中白細(xì)胞數(shù),結(jié)果模型組小鼠血液白細(xì)胞數(shù)低于對照組,蠐螬組小鼠血液白細(xì)胞總數(shù)均高于模型組,隨著劑量增加白細(xì)胞數(shù)提高,且高劑量組呈現(xiàn)極顯著性差異,結(jié)果提示蠐螬多肽能增加小鼠血液中白細(xì)胞的數(shù)量(表2)。表2蠐螬多肽對免疫抑制小鼠白細(xì)胞與溶血素的影響a)P0.05,b)P0.01,vscontrolgroup;c)P0.05,d)P0.01,vsmodelgroup.圖6流式細(xì)胞技術(shù)分析蠐螬多肽對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Fig6Effectsofgrubpolypeptidesonthephagocytosisfunctionofmacrophagesfromimmunosuppressivemicedetectedbyflowcytometrytechnology*P0.05,**P0.01,vsmodelgroup.2.6、蠐螬多肽對免疫抑制小鼠DTH反響強(qiáng)度的影響DTH是檢測細(xì)胞免疫功能的常用方式方法,通過稱重小鼠左右耳片質(zhì)量,計(jì)算耳腫脹度。結(jié)果模型組小鼠耳腫脹度顯著低于對照組,中高劑量蠐螬多肽組小鼠耳腫脹度高于模型組,隨著蠐螬劑量增加耳腫脹度顯著增加,存在著劑量效應(yīng)關(guān)系(圖7)。圖7蠐螬多肽對免疫抑制小鼠DTH反響強(qiáng)度的影響Fig7EffectsofgrubpolypeptideonDTHresponseintensityinimmunosuppressedmice*P0.05,vscontrolgroup;△P0.05,△△P0.01,vsmodelgroup.3、討論活性肽是由20種天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成的環(huán)形或線性肽類的總稱,源于蛋白質(zhì)的功能性化合物,而活性肽在母體蛋白中通常沒有活性[12],因而生物活性肽的制備引起越來越多的學(xué)者關(guān)注和研究。當(dāng)前制備生物活性肽的最常用方式方法是酶水解法,經(jīng)酶解植物或動(dòng)物蛋白獲得多肽具有良好的理化性質(zhì)和功能性質(zhì)[13,14]。酶解的條件對活性多肽的制備都有至關(guān)重要,蛋白酶在最適的環(huán)境下到達(dá)最大酶解效率。本實(shí)驗(yàn)酶解的條件料液比1∶20、酶解時(shí)間2.5h和加酶量6000U,獲得螬多肽濃度為37.01mg/ml,提取率為31.63%,Mr為8000～9000。環(huán)磷酰胺(CY)作為癌癥化學(xué)治療藥物,是一種作用強(qiáng)、療效好的常用免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床建立小鼠免疫抑制模型,用來觀察免疫促進(jìn)藥物對免疫功能的影響,但因其非特異性的毒性作用,除殺傷癌細(xì)胞外對正常細(xì)胞具有毒性作用[15,16,17]。本研究結(jié)果表示清楚,與正常對照組比擬,CY模型組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖、NO分泌和巨噬細(xì)胞吞噬功能明顯被抑制,血清溶血素含量顯著降低,結(jié)果表示清楚環(huán)磷酰胺具有明顯的免疫毒性。白細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分,白細(xì)胞數(shù)降低,提示機(jī)體抵御細(xì)菌入侵的能力減弱,易受感染。本研究蠐螬多肽能使免疫低下小鼠的外周血白細(xì)胞數(shù)升高至正常水平,表示清楚蠐螬多肽能夠改善機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一,蠐螬多肽提高免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力,對免疫抑制小鼠吞噬功能有促進(jìn)作用。免疫器官的發(fā)育決定了免疫功能的強(qiáng)弱,機(jī)體免疫功能情況可由淋巴細(xì)胞的增殖能力間接反映,如淋巴細(xì)胞的活化以及分化為免疫活性細(xì)胞,進(jìn)而加強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力[18]。本試驗(yàn)淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示高劑量蠐螬多肽能夠促進(jìn)免疫抑制小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖,低劑量促進(jìn)作用不明顯。DTH具體表現(xiàn)出了機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài),是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[19]。本研究結(jié)果顯示,蠐螬多肽能夠加強(qiáng)小鼠DTH強(qiáng)度,且存在計(jì)量效應(yīng)關(guān)系,隨蠐螬多肽的濃度增加而加強(qiáng)。講明蠐螬多肽能夠改善免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能。NO是一種細(xì)胞間信息傳遞的雙向調(diào)節(jié)因子,能緩解血管平滑肌緊張度、影響淋巴細(xì)胞增殖、免疫應(yīng)答等。研究報(bào)道,細(xì)菌脂多糖能使免疫細(xì)胞NO分泌量升高,加強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[20]。研究結(jié)果表示清楚蠐螬多肽促進(jìn)免疫抑制小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌NO,提示其介入免疫調(diào)節(jié)。異源動(dòng)物紅細(xì)胞免疫動(dòng)物后,B淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗RBC抗體,即溶血素。這種抗體在體外與免疫源性RBC溫育后,在補(bǔ)體介入下可產(chǎn)生溶血反響,檢測反響體系溶血后光密度吸收值能夠反映溶血素水平,B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力,以此評價(jià)機(jī)體的體液免疫功能[21,22]。試驗(yàn)結(jié)果蠐螬組小鼠外周血溶血素含量明顯高于模型組,低劑量蠐螬多肽可極顯著提高免疫抑制小鼠外周血溶血素含量,拮抗CY所致的體液免疫抑制,表示清楚蠐螬多肽能夠提高小鼠體液免疫能力。綜上所述,蠐螬多肽能對免疫抑制藥環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制小鼠特異性及非特異性免疫功能均有促進(jìn)作用,試驗(yàn)結(jié)果提示其可有望成為一種新的安全高效的免疫調(diào)節(jié)劑開發(fā),但其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。以下為參考文獻(xiàn)[1]國家藥典委員會.中國藥典一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2018:附錄45.[2]陳智,鄭學(xué)燕,朱榮剛,等.蠐螬化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品,2020,16(1):62-64.[3]陽長明,侯世祥,王新春,等.蠐螬與蠐螬滴眼液的成分研究[J].中藥材,2000,23(12):769-771.[4]金哲,孫抒,李基俊,等.蠐螬提取物體外對人MGC-803胃癌細(xì)胞株凋亡相關(guān)基因作用的研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2004,11(2):90-92.[5]陳梅,邱曉星,彭清華,等.蠐螬提取物對兔脈絡(luò)膜新生血管VEGF和bFGF表示出的影響[J].國際眼科雜志,2008,8(12):2443-2448.[6]喇文軍,劉冬,張力君,等.離子交換層析法分離純化玉米降血壓肽的研究[J].食品工程,2007,9(3):57-60.[7]嚴(yán)銘銘,曲曉波,王旭,等.梅花鹿茸中活性多肽的純化、測序及功能研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2007,20(28):1893-1896.[8]運(yùn)晨霞,余曉玲,吳光,等.三葉黃合劑對小鼠細(xì)胞免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2018,20(5):1155-1157.[9]MaH,LiuG,DingW,etal.Diabetes-inducedalterationofF4/80(+)macrophages:astudyinmicewithstreptozotocininduceddiabetesforalongterm[J].JMolMed,2008,86(4):391-400.[10]SwanR,ChungCS,AlbinaJ,etal.Polymicrobi