3種家兔破損皮膚模型中的制劑透過率對比,藥學論文

3種家兔破損皮膚模型中的制劑透過率對比,藥學論文經(jīng)皮給藥制劑又稱經(jīng)皮給藥系統(tǒng)〔transdermaldrugdeliverysystem,TDDS〕或稱透皮治療系統(tǒng)〔transdermaltherapeuticsystem,TTS〕，是藥物通過皮膚吸收后轉(zhuǎn)運至局部組織或全身血液循環(huán)而發(fā)生局部或全身作用的制劑[1].此類制劑的安全性評價常因其劑型、給藥途徑等特殊性而有一定難度，主要由于經(jīng)皮給藥后的實際劑量及毒性暴露量和毒性反響程度取決于透入皮膚的藥量，而臨床上皮膚病變往往改變了正常皮膚屏障完好性和藥物通透性，藥物的透皮吸收率除了受藥物本身理化特性、給藥方式方法等因素限制外，還常因皮膚屏障功能狀態(tài)遭到不同程度的影響[2-3],因而，在刺激性和長期毒性試驗中通常需將破損皮膚模型用于試驗，以充分暴露受試物的局部刺激性或/和全身毒性。

當前，國內(nèi)通常采用體外擴散池法、殘留量分析法和在體微透析法等方式方法進行經(jīng)皮給藥制劑的透過率或藥動學方面的研究[4-5];安全性評價實驗室常用的破損皮膚制備方式方法有針頭劃傷、砂紙打磨、鈍器刮傷或由脫毛劑造成的表皮損傷[6].但動物破損皮膚與人臨床不同疾病下皮膚的角質(zhì)層狀態(tài)并不完全一致，并且實驗操作者在選擇上述制備方式方法時通常考慮的多是操作的方便程度，往往憑經(jīng)歷體驗以肉眼判定破損程度，忽視了脫毛經(jīng)過所致角質(zhì)層損失差異和皮膚破損模型制備方式方法及其他因素對實際的病理損傷程度及藥物透過率產(chǎn)生的影響，進而可能對經(jīng)皮給藥制劑的毒性評價帶來不同程度的干擾。

本文以草烏甲素凝膠膏為受試物，選用針頭劃傷、砂紙打磨、4%Na2S脫毛劑處理這3種有代表性的皮膚破損方式方法制備家兔破損皮膚，以體外擴散池法開展體外透皮實驗，考察上述方式所得破損皮膚的體外吸收特征，并從破損皮膚的組織病理學形態(tài)和藥物皮膚體外浸透速率這兩個方面討論不同破損皮膚模型制備方式方法及因素產(chǎn)生的差異及影響，為經(jīng)皮給藥制劑毒性暴露和安全性評價選擇更為科學合理的病理模型提供實用的技術(shù)方式方法。

1材料和方式方法

1.1儀器

Agilent1200SL液相色譜儀〔Agilent,二元泵，自動進樣器〕；API3200Q-Trap三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜〔美國AB公司〕；Analyst1.5工作站；智能透皮試驗儀〔天津富蘭斯YB-P6〕；分析天平〔美國Ohaus公司〕；Allegra64R高速冷凍臺式離心機〔美國Backman公司〕；XW-80A渦旋混合器〔上海精科實業(yè)有限公司〕；MD200氮吹儀〔杭州奧盛儀器有限公司〕；寵物用電推剪〔上海CODOSKP-3000〕；組織病理學檢查儀器均為德國Leica公司。

1.2試藥

草烏甲素凝膠膏〔載藥量約為0.06mg/cm,云南省藥物研究所，批號202007〕；草烏甲素對照品〔質(zhì)量分數(shù)98%,中國食品藥品檢定研究院，批號100530-200501〕；次烏頭堿〔質(zhì)量分數(shù)98%,北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司，批號MUST-13011706〕；甲醇〔色譜純，德國Merck公司〕；其余試劑均為分析純。

1.3動物

普通級日本大耳白家兔6只，雌雄各半，3~4月齡，2.4~3.0kg,來源于昆明市艾尼莫實驗動物養(yǎng)殖中心，許可證號：SCXK〔滇〕K2020-0002.

1.4LC-MS/MS檢測條件

1.4.1色譜條件色譜柱為AgilentponoshellSB-C18柱〔50mm4.6mm,2.7m〕；流動相為0.1%甲酸10mmol/L醋酸銨水溶液-甲醇〔12∶88〕；體積流量0.5mL/min;柱溫20℃；進樣量5L.

1.4.2質(zhì)譜條件ESI源，POS形式，MRM定量。

草烏甲素[M+H]+1[M+H]+為m/z616.3556.2.質(zhì)譜參數(shù)：CUR10.0,IS5500.0,TEM300.00,GS125.00,GS235.00,iheON,CADLOW,DP72.0,EP10.00.

1.5檢測樣本預處理

精致細密參加10L內(nèi)標工作液至2mLEP管中，氮吹至干，再精致細密移取100L經(jīng)擴散池收取的PBS溶液，旋渦2min,參加1mL醋酸乙酯，渦旋3min,4000r/min離心10min,取上清600L,氮氣吹干，200L甲醇復溶，15000r/min離心10min,取上清，5L進樣。

1.6離體破損皮膚制備

破損皮膚的破損程度參照2020年5月13日公布的(藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導原則〕的附錄中有關(guān)3.皮膚刺激性試驗對破損皮膚破損程度的描繪敘述，即破損皮膚試驗中皮膚破損程度以損傷表皮層為限[7],故本實驗中選擇了3種有代表性的制備方式方法來獲得破損皮膚，并結(jié)合組織病理學檢查結(jié)果綜合判定，確定皮膚的最適破損程度。

1.6.1破損方式方法家兔乙醚麻醉后，用寵物電推剪先將背部毛盡量剔除干凈，剔除經(jīng)過中注意勿將兔皮膚劃傷。將6只去毛后的家兔分為3個組，每組2只。按下面3種方式制備破損皮膚。

A法：針頭劃即用5mL一次性注射器針頭在家兔皮膚外表間隔3mm劃多條橫線，再間隔3mm劃多條豎線，構(gòu)成多個井字，深度以皮膚外表變淺紅即可。

B法：砂紙打磨即將砂紙包裹在木棒上，然后在家兔皮膚外表輕輕摩擦，直至皮膚外表變?yōu)闇\紅。

C法：化學脫毛劑即將紗布浸于4%Na2S中，再將紗布敷于家兔皮膚5min后取下，以干凈紗布擦凈皮膚外表殘存余留Na2S,再用大量清水沖洗至Na2S除凈。

1.6.2離體破損皮膚制備6只家兔分為3組，按上述3種方式方法破損皮膚后及時頸總動脈放血安泰死，剖取上述3種方式方法制備的破損皮膚各約66cm2,除去皮下組織和脂肪，以生理鹽水沖洗適當時間，每種方式方法所獲的每塊破損皮膚均分為兩部分，華而不實一部分皮膚置福爾馬林溶液中固定，用于組織病理學檢查，以確定皮膚破損程度能否適宜，另外一部分皮膚則用于體外透皮實驗。

1.7破損皮膚病理學檢查

病理取材厚度2~3mm,長度約1~2cm,切片厚度3m,HE染色、制片，進行組織病理學鏡檢，據(jù)鏡檢結(jié)果對各塊破損皮膚所見病變程度進行半定量分級。

1.8家兔破損皮膚體外透皮試驗

取草烏甲素凝膠膏，按擴散池接收口內(nèi)徑大小〔1.17cm2〕將凝膠膏剪切，待用。將按1.6要求制備的離體破損皮膚固定于改進Franz擴散池上，皮內(nèi)層面向下〔朝向擴散池內(nèi)方〕，皮外層面向上，將剪好的草烏甲素凝膠膏揭去保衛(wèi)層，緊貼于皮膚外層，用夾子將擴散池組合夾緊固定。擴散池接收室事先放入磁力攪拌子，并加滿32℃的0.05mol/L、pH7.4PBS溶液作為接收介質(zhì)〔12mL〕，排出接收室中的氣泡，使家兔皮膚內(nèi)層與接收介質(zhì)嚴密接觸，池外以32℃水浴保溫，磁力攪拌子以350r/min的速度攪拌，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、10、11和24h從接收池中抽取0.3mL的PBS接受液，同時向接收池中補充等量32℃的0.05mol/L、pH7.4的PBS溶液。將收集的PBS接收液置于2~8℃?zhèn)浯?，待所有時間點PBS接收液均收集后，分別按1.5項下方式方法處理、分析檢測。

1.9數(shù)據(jù)處理

通過各時間點樣品測定結(jié)果，計算每個時間點單位面積的累積釋藥量〔Q〕，并對結(jié)果進行評價。

Q=〔PnV+V0-=11niip〕/A10為每次取樣的體積，Pn為第n次所取樣品測定的藥物濃度，pi為第i個樣品的藥物濃度測定值，A為擴散池中家兔皮膚的有效擴散面積。

2結(jié)果

2.1特異性

在本實驗LC-MS/MS檢測條件下草烏甲素及內(nèi)標次烏頭堿峰形均良好，在各自檢測通道內(nèi)未見干擾峰，兩者保存時間分別為1.21min和1.19min,結(jié)果見圖1.

2.2基質(zhì)效應

本實驗考察了空白PBS溶液經(jīng)提取后，內(nèi)源性雜質(zhì)對草烏甲素和內(nèi)標次烏頭堿的離子抑制情況。

結(jié)果顯示，草烏甲素PBS溶液質(zhì)控樣品在1.987、31.80、509.0ng/mL這3個質(zhì)量濃度下的基質(zhì)效應〔n=6〕分別為96.49%、94.92%、97.28%;內(nèi)標次烏頭堿基質(zhì)效應〔n=18〕為93.27%.

2.3標準曲線和線性范圍

以草烏甲素PBS溶液質(zhì)量濃度C〔分別為0.1242、0.4967、1.987、7.950、31.80、127.0、509.0ng/mL〕為橫坐標，草烏甲素峰面積〔Ab〕和內(nèi)標峰面積〔Ah〕比值為縱坐標Y,做線性回歸，得回歸方程為：Y=0.0189C-0.00257〔r=0.9928〕，權(quán)重系數(shù)w=1/C2,藥物濃度與峰面積間線性關(guān)系良好，線性范圍為0.1242~509.0ng/mL,最低定量限為0.1242ng/mL〔S/N10〕。

2.4精致細密度和準確度

制備質(zhì)量濃度分別為1.987、31.80、509.0ng/mL的草烏甲素PBS溶液質(zhì)控樣品，按1.5項下操作，重復3d,據(jù)隨行的標準曲線計算測定濃度，由實測濃度計算批內(nèi)與批間精致細密度，每批實測濃度的平均值與理論濃度的比值為準確度，結(jié)果見表1.

2.5回收率

制備質(zhì)量濃度分別為1.987、31.80、509.0ng/mL的草烏甲素PBS溶液質(zhì)控樣品，按1.5項下操作，測定得峰面積為A;精致細密移取100L空白PBS溶液按2.2項下操作提取后得到的含基質(zhì)殘渣，用濃度分別為1.987、31.80、509.0ng/mL的草烏甲素工作液復溶，測定得峰面積B.A和B的百分比即為提取回收率，結(jié)果見表1.【1】

2.6穩(wěn)定性

制備濃度分