功能蛋白質(zhì)組學研究方法課件

功能蛋白質(zhì)組學1ppt課件.功能蛋白質(zhì)組學1ppt課件.

功能蛋白質(zhì)組學是指對蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與DNA/RNA間的相互作用的研究。以細胞內(nèi)與某個功能有關(guān)或某種條件下的一群蛋白質(zhì)為主要研究內(nèi)容，由此建立細胞內(nèi)外信號傳遞的復雜網(wǎng)絡(luò)。2ppt課件.功能蛋白質(zhì)組學是指對蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與DNA/RNA蛋白質(zhì)芯片技術(shù)噬菌體展示技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)3ppt課件.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)3ppt課件.蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片是將大量蛋白質(zhì)分子按預先設(shè)置的排列固定于一種載體表面，形成微陣列，根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，構(gòu)建微流體生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對生物分子的準確、快速、大信息量的檢測。

4ppt課件.蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片是將大量蛋白質(zhì)分子按預先設(shè)置的排依據(jù)被檢測蛋白樣品的標記種類來選擇不同的檢測設(shè)備對蛋白質(zhì)芯片反應結(jié)果的檢測。熒光標記是芯片息采集中使用最多也是最成功的報告標志。雜交反后的芯片上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以進行分析，將熒光信號轉(zhuǎn)成數(shù)據(jù)，即可獲得有關(guān)生物信息。5ppt課件.依據(jù)被檢測蛋白樣品的標記種類來選擇不同的檢測設(shè)備對蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片分類根據(jù)固定介質(zhì)的不同,可以分為兩大類:

化學型蛋白質(zhì)芯片（SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片）生物型蛋白質(zhì)芯片（如抗體、受體、配體等）；根據(jù)片基材料的不同可以分為：膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。

6ppt課件.蛋白質(zhì)芯片分類根據(jù)固定介質(zhì)的不同,可以分為兩大類:6ppt課

目前常用蛋白質(zhì)芯片有：

1.SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片

2.抗體芯片

3.靶蛋白質(zhì)芯片

4.液相蛋白質(zhì)芯片7ppt課件.目前常用蛋白質(zhì)芯片有：7ppt課件.SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片

表面加強激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeofflight-massspectrometry，SELDI-TOF-MS

）蛋白質(zhì)芯片由３部分組成：蛋白質(zhì)芯片、閱讀器和分析軟件。蛋白質(zhì)芯片是核心部分，芯片上固定的介質(zhì)可以是陰離子、陽離子、疏水性、親水性、金屬等，根據(jù)蛋白質(zhì)的化學特性而有選擇性地捕獲特異的蛋白質(zhì)。

8ppt課件.SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片表面加強激光解吸電離-

ＳＥＬＤＩ技術(shù)的基本原理:

將待測樣品(血清、尿液、分泌液、細胞裂解液等)滴到芯片表面，通過親合作用樣品中的某些蛋白質(zhì)被吸附到芯片的固相基質(zhì)表面上，用緩沖液洗去芯片上的雜質(zhì)蛋白和其他污染物，然后在芯片上加入能量吸收分子（energyabsorbingmolecular,EAM），芯片干燥后，在真空管中用激光轟擊，蛋白質(zhì)在吸收能量后被解析發(fā)生離子化，

在電場力作用下脫離芯片表面，

被離子檢測器所檢測。檢測結(jié)果經(jīng)過軟件分析處理后，

可繪制出質(zhì)譜圖，顯示相關(guān)蛋白質(zhì)的分子量、含量等信息。9ppt課件.ＳＥＬＤＩ技術(shù)的基本原理:9ppt課件.抗體芯片

抗體芯片主要研究在不同生理或病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)水平的量變。微型化、集成化、高通量化是抗體芯片重要特點。芯片上排列了許多已知蛋白質(zhì)的單克隆抗體，這些單克隆抗體對應的蛋白質(zhì)（抗原）都是細胞結(jié)構(gòu)和功能上十分重要的蛋白，涉及信號傳導、腫瘤、細胞周期調(diào)控、細胞結(jié)構(gòu)、細胞凋亡等廣泛的領(lǐng)域?？贵w芯片檢測的結(jié)果不是蛋白質(zhì)的絕對含量而是目的蛋白質(zhì)在兩個樣品之間的相對峰度。

10ppt課件.抗體芯片10ppt課件.靶蛋白質(zhì)芯片

主要用于蛋白質(zhì)相互作用研究、蛋白表達研究和小分子蛋白結(jié)合研究。

靶蛋白質(zhì)的獲得：1.化學合成；2.基因工程表達蛋白質(zhì)并進行純化、點樣制作芯片；3.將活的生物體(如細菌、酵母等)在芯片上原位表達蛋白質(zhì)（living芯片）。4.將核酸固定在芯片介質(zhì)中，然后利用不依賴細胞的體外蛋白表達系統(tǒng)，在原位合成靶蛋白。11ppt課件.靶蛋白質(zhì)芯片主要用于蛋白質(zhì)相互作用研究液相蛋白質(zhì)芯片

是一種新型的、高度靈活的多元蛋白質(zhì)研究平臺。液相芯片體系由許多不同的小球體為主要基質(zhì)，每種小球體上固定有不同的探針分子，將這些小球體懸浮于一個液相體系中，就構(gòu)成了一個液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)。在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，在球形基質(zhì)的制造過程當中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種紅色分類熒光的比例不同(色彩編號)，區(qū)分不同的探針?？赏瑫r固定各種蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物分子，可以對同一個樣品中的多個不同的分子同時進行檢測。

12ppt課件.液相蛋白質(zhì)芯片

是一種新型的、高度靈活的多元蛋白質(zhì)研究噬菌體展示技術(shù)自1985年SmithGP等創(chuàng)建噬菌體展示技術(shù)，其原理是：以經(jīng)過改建的噬菌體為載體，把外源基因插入噬菌體外殼蛋白基因PⅢ區(qū)或PⅧ區(qū)，從而使表達的外源肽或蛋白質(zhì)展示在噬菌體的表面，并使表達產(chǎn)物保持良好的空間構(gòu)象。進而通過親和富集法篩選表達有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體，最終獲得具有特異結(jié)合性質(zhì)的多肽/蛋白質(zhì)。13ppt課件.噬菌體展示技術(shù)自1985年SmithGP等創(chuàng)建噬菌體展示14ppt課件.14ppt課件.

這一技術(shù)有效地實現(xiàn)了基因型和表型的體外轉(zhuǎn)換，即在二者之間架起了聯(lián)結(jié)的橋梁，使得研究者完全可以在分子克隆的基礎(chǔ)上，有效地實現(xiàn)蛋白質(zhì)構(gòu)象的體外控制，從而可以在體外獲得具有良好生物學活性的表達產(chǎn)物。15ppt課件.這一技術(shù)有效地實現(xiàn)了基因型和表型的體外轉(zhuǎn)換，即在二者之Navagen公司用T7噬菌體構(gòu)建的各種cDNA表達文庫，將外源基因序列插入到編碼T7噬菌體包膜蛋白基因中所表達的多肽或蛋白質(zhì)以與噬菌體包膜蛋白融合的形式展示在噬菌體表面。T7噬菌體展示文庫可以展示相當部分表達的蛋白質(zhì)，甚至可以保持蛋白的一定構(gòu)象。因此，該系統(tǒng)最大程度地再現(xiàn)了細胞內(nèi)的真實情況，所篩選出的結(jié)合蛋白與自然狀態(tài)較為接近。目前已被成功應用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、抗原-抗體以及DNA-蛋白質(zhì)之間作用的研究，為功能基因組學的研究提供了一種新的方法。

16ppt課件.Navagen公司用T7噬菌體構(gòu)建的各種cDNA表達文庫，將cDNA庫是在噬菌體衣殼蛋白的基因中插入從某些組織或細胞中抽提出來的mRNA的互補DNA片段，從而表達該組織或細胞的各種蛋白于噬菌體的表面。

如：抗體庫的構(gòu)建

17ppt課件.cDNA庫是在噬菌體衣殼蛋白的基因中插入從某些組織或細胞中抽表達載體噬菌粒pCANTAB5E18ppt課件.表達載體噬菌粒pCANTAB5E18ppt課件.噬菌體展示技術(shù)的應用1.與蛋白質(zhì)相互作用的研究

有研究利用T7噬菌體展示篩選系統(tǒng)，以絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路中p38作為靶蛋白，篩選了與其有結(jié)合關(guān)系的多肽或蛋白，得到了46個編碼蛋白的序列，在這些蛋白中有激酶、轉(zhuǎn)錄因子、細胞骨架相關(guān)蛋白和離子通道相關(guān)蛋白等。

19ppt課件.噬菌體展示技術(shù)的應用1.與蛋白質(zhì)相互作用的研究19ppt2.在篩選和制備多肽藥物方面的研究及應用隨機噬菌體展示多肽文庫：一組隨機編碼序列或基因群插入噬菌體載體進行表達及展示時,就形成噬菌體展示文庫，在文庫中,每個噬菌體粒子只展示一種序列的外源肽鏈,不同噬菌體粒子展示不同序列的外源肽鏈。用一定功能的靶分子篩選，可以簡便快速地獲得與靶分子具有強親和力和特異性的小肽或新型蛋白，這些肽段可以作為侯選藥物進行開發(fā)。20ppt課件.2.在篩選和制備多肽藥物方面的研究及應用20ppt課件.

3在疾病的治療和致病機理方面的研究

有研究以HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A作為固相靶分子，用T7噬菌體表面展示的人肝細胞cDNA文庫進行5輪篩選后，確定了與HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A結(jié)合的是肝細胞蛋白絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）激活蛋白激酶5（MAPKAPK5），為進一步研究HCV的致病機制奠定了基礎(chǔ)。

21ppt課件.3在疾病的治療和致病機理方面的研究21ppt課件.酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交技術(shù)由Fields等人于1989年提出。該技術(shù)利用了酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)，GAL4包括兩個彼此分離但功能上必需的結(jié)構(gòu)域,一個是位于N端1-174位氨基酸殘基區(qū)段的DNA結(jié)合(DNAbindingdomain,DNA-BD),另一個是位于C端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(Activationdomain,AD）。22ppt課件.酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交技術(shù)由Fields等人于1989年DNA-BD能夠識別GAL4效應基因的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS),并與之結(jié)合，而AD則通過與轉(zhuǎn)錄機制中的其他成分之間的作用,啟動UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。DNA-BD和AD單獨作用均不能激活轉(zhuǎn)錄反應,只有當二者在空間上充分接近并呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性時,方可激活UAS下游啟動。23ppt課件.DNA-BD能夠識別GAL4效應基因的上游激活序列(Up該系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄激活的條件是蛋白質(zhì)作為一個整體起作用。分別經(jīng)分子克隆技術(shù)在同一細胞中表達的BD和AD多肽不會彼此間發(fā)生作用，BD和AD分別可以同其他蛋白質(zhì)X或Y結(jié)合形成融合蛋白,如果X，Y之間可以形成蛋白-蛋白復合物,使GAL4兩個結(jié)構(gòu)域重新構(gòu)成AD和BD成為一體,就可以啟動特異基因序列的轉(zhuǎn)錄。24ppt課件.該系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄激活的條件是蛋白質(zhì)作為一個整體起作用。24pptGAL4重建后激活轉(zhuǎn)錄模式圖BDADXYUAS報告基因（LacZ）25ppt課件.GAL4重建后激活轉(zhuǎn)錄模式圖BDADXYUAS報告基因（一般地,將BD-X的融合蛋白稱作誘餌(bait),X往往是已知蛋白,AD-Y稱作獵物(prey),能顯示誘餌和獵物相互作用的基因稱報告基因,通過對報告基因的檢測,反過來可判斷誘餌和獵物之間是否存在相互作用。26ppt課件.一般地,將BD-X的融合蛋白稱作誘餌(bait),X往往是

作為一種分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的簡便而有效的研究體系,酵母雙雜交的最大的優(yōu)點是不需要分離、純化蛋白質(zhì),整個過程只是對核酸進行操作。27ppt課件.作為一種分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的簡便而有效的研酵母雙雜交系統(tǒng)應用

它主要應用在以下幾個方面:1.用于驗證通過其他方法發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)之間是否有相互作用;2.確定已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結(jié)構(gòu)域;3.篩選文庫以得到與已知蛋白質(zhì)存在特異相互作用的候選蛋白質(zhì)。

28ppt課件.酵母雙雜交系統(tǒng)應用

它主要應用在以下幾個方面:28pp酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性1.并非對所有蛋白質(zhì)都適用雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工,如糖基化,二硫鍵形成等,這些反應在核內(nèi)無法進行。另外,有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其它非酵母蛋白的輔助,這限制了某些細胞核外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。29ppt課件.酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性1.并非對所有蛋白質(zhì)都適用29ppt課2.假陽性的發(fā)生

假陽性分為兩類：一類是生物學上的假陽性即蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用在酵母細胞中發(fā)生,但是在其生物體細胞內(nèi)并不發(fā)生相互作用，這主要是因為兩種蛋白不同時表達或者二者根本不在同一組織中，這種假陽性,我們?nèi)绻麑λ芯康牡鞍踪|(zhì)的生物學特性沒有深入了解的話,是很難排除的。30ppt課件.2.假陽性的發(fā)生30ppt課件.另一類是技術(shù)上的假陽性即由于雙雜交技術(shù)上的局限而鑒定出的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用。

包括篩庫過程中自發(fā)升高的BD-x融合蛋白自我激活導致的假陽性，在BD-x融合蛋白不存在的情況下AD-Y融合蛋白單獨激活報告基因，導致的假陽性,以及酵母中其他蛋白質(zhì)作用引起的假陽性等。31ppt課件.另一類是技術(shù)上的假陽性31ppt課件.

因此，雖然雙雜交系統(tǒng)可篩選出大量蛋白質(zhì)相互作用,但其中部分蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)下可能不發(fā)生相互作用,雙雜交只是反映蛋白質(zhì)間能發(fā)生作用的可能性,這種可能性還必須經(jīng)過其他實驗驗證,尤其要與生理功能研究相結(jié)合,否則可能會誤入歧途。32ppt課件.因此，雖然雙雜交系統(tǒng)可篩選出大量蛋白質(zhì)相互作用,但其中酵母雙雜交體系的新發(fā)展傳統(tǒng)酵母雙雜交體系的改建

根據(jù)酵母的營養(yǎng)缺陷,發(fā)展了多重篩選機制表達載體構(gòu)建的改進將蛋白的相互作用場所從核內(nèi)移至細胞膜哺乳動物細胞雙雜交系統(tǒng)三雜交系統(tǒng)的產(chǎn)生：用于研究蛋白和RNA間的相互作用。33ppt課件.酵母雙雜交體系的新發(fā)展傳統(tǒng)酵母雙雜交體系的改建33ppt課件此課件下載可自行編輯修改，供參考！感謝您的支持，我們努力做得更好！此課件下載可自行編輯修改，供參考！功能蛋白質(zhì)組學35ppt課件.功能蛋白質(zhì)組學1ppt課件.

功能蛋白質(zhì)組學是指對蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與DNA/RNA間的相互作用的研究。以細胞內(nèi)與某個功能有關(guān)或某種條件下的一群蛋白質(zhì)為主要研究內(nèi)容，由此建立細胞內(nèi)外信號傳遞的復雜網(wǎng)絡(luò)。36ppt課件.功能蛋白質(zhì)組學是指對蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與DNA/RNA蛋白質(zhì)芯片技術(shù)噬菌體展示技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)37ppt課件.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)3ppt課件.蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片是將大量蛋白質(zhì)分子按預先設(shè)置的排列固定于一種載體表面，形成微陣列，根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，構(gòu)建微流體生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對生物分子的準確、快速、大信息量的檢測。

38ppt課件.蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片是將大量蛋白質(zhì)分子按預先設(shè)置的排依據(jù)被檢測蛋白樣品的標記種類來選擇不同的檢測設(shè)備對蛋白質(zhì)芯片反應結(jié)果的檢測。熒光標記是芯片息采集中使用最多也是最成功的報告標志。雜交反后的芯片上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以進行分析，將熒光信號轉(zhuǎn)成數(shù)據(jù)，即可獲得有關(guān)生物信息。39ppt課件.依據(jù)被檢測蛋白樣品的標記種類來選擇不同的檢測設(shè)備對蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片分類根據(jù)固定介質(zhì)的不同,可以分為兩大類:

化學型蛋白質(zhì)芯片（SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片）生物型蛋白質(zhì)芯片（如抗體、受體、配體等）；根據(jù)片基材料的不同可以分為：膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。

40ppt課件.蛋白質(zhì)芯片分類根據(jù)固定介質(zhì)的不同,可以分為兩大類:6ppt課

目前常用蛋白質(zhì)芯片有：

1.SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片

2.抗體芯片

3.靶蛋白質(zhì)芯片

4.液相蛋白質(zhì)芯片41ppt課件.目前常用蛋白質(zhì)芯片有：7ppt課件.SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片

表面加強激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeofflight-massspectrometry，SELDI-TOF-MS

）蛋白質(zhì)芯片由３部分組成：蛋白質(zhì)芯片、閱讀器和分析軟件。蛋白質(zhì)芯片是核心部分，芯片上固定的介質(zhì)可以是陰離子、陽離子、疏水性、親水性、金屬等，根據(jù)蛋白質(zhì)的化學特性而有選擇性地捕獲特異的蛋白質(zhì)。

42ppt課件.SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片表面加強激光解吸電離-

ＳＥＬＤＩ技術(shù)的基本原理:

將待測樣品(血清、尿液、分泌液、細胞裂解液等)滴到芯片表面，通過親合作用樣品中的某些蛋白質(zhì)被吸附到芯片的固相基質(zhì)表面上，用緩沖液洗去芯片上的雜質(zhì)蛋白和其他污染物，然后在芯片上加入能量吸收分子（energyabsorbingmolecular,EAM），芯片干燥后，在真空管中用激光轟擊，蛋白質(zhì)在吸收能量后被解析發(fā)生離子化，

在電場力作用下脫離芯片表面，

被離子檢測器所檢測。檢測結(jié)果經(jīng)過軟件分析處理后，

可繪制出質(zhì)譜圖，顯示相關(guān)蛋白質(zhì)的分子量、含量等信息。43ppt課件.ＳＥＬＤＩ技術(shù)的基本原理:9ppt課件.抗體芯片

抗體芯片主要研究在不同生理或病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)水平的量變。微型化、集成化、高通量化是抗體芯片重要特點。芯片上排列了許多已知蛋白質(zhì)的單克隆抗體，這些單克隆抗體對應的蛋白質(zhì)（抗原）都是細胞結(jié)構(gòu)和功能上十分重要的蛋白，涉及信號傳導、腫瘤、細胞周期調(diào)控、細胞結(jié)構(gòu)、細胞凋亡等廣泛的領(lǐng)域?？贵w芯片檢測的結(jié)果不是蛋白質(zhì)的絕對含量而是目的蛋白質(zhì)在兩個樣品之間的相對峰度。

44ppt課件.抗體芯片10ppt課件.靶蛋白質(zhì)芯片

主要用于蛋白質(zhì)相互作用研究、蛋白表達研究和小分子蛋白結(jié)合研究。

靶蛋白質(zhì)的獲得：1.化學合成；2.基因工程表達蛋白質(zhì)并進行純化、點樣制作芯片；3.將活的生物體(如細菌、酵母等)在芯片上原位表達蛋白質(zhì)（living芯片）。4.將核酸固定在芯片介質(zhì)中，然后利用不依賴細胞的體外蛋白表達系統(tǒng)，在原位合成靶蛋白。45ppt課件.靶蛋白質(zhì)芯片主要用于蛋白質(zhì)相互作用研究液相蛋白質(zhì)芯片

是一種新型的、高度靈活的多元蛋白質(zhì)研究平臺。液相芯片體系由許多不同的小球體為主要基質(zhì)，每種小球體上固定有不同的探針分子，將這些小球體懸浮于一個液相體系中，就構(gòu)成了一個液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)。在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，在球形基質(zhì)的制造過程當中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種紅色分類熒光的比例不同(色彩編號)，區(qū)分不同的探針?？赏瑫r固定各種蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物分子，可以對同一個樣品中的多個不同的分子同時進行檢測。

46ppt課件.液相蛋白質(zhì)芯片

是一種新型的、高度靈活的多元蛋白質(zhì)研究噬菌體展示技術(shù)自1985年SmithGP等創(chuàng)建噬菌體展示技術(shù)，其原理是：以經(jīng)過改建的噬菌體為載體，把外源基因插入噬菌體外殼蛋白基因PⅢ區(qū)或PⅧ區(qū)，從而使表達的外源肽或蛋白質(zhì)展示在噬菌體的表面，并使表達產(chǎn)物保持良好的空間構(gòu)象。進而通過親和富集法篩選表達有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體，最終獲得具有特異結(jié)合性質(zhì)的多肽/蛋白質(zhì)。47ppt課件.噬菌體展示技術(shù)自1985年SmithGP等創(chuàng)建噬菌體展示48ppt課件.14ppt課件.

這一技術(shù)有效地實現(xiàn)了基因型和表型的體外轉(zhuǎn)換，即在二者之間架起了聯(lián)結(jié)的橋梁，使得研究者完全可以在分子克隆的基礎(chǔ)上，有效地實現(xiàn)蛋白質(zhì)構(gòu)象的體外控制，從而可以在體外獲得具有良好生物學活性的表達產(chǎn)物。49ppt課件.這一技術(shù)有效地實現(xiàn)了基因型和表型的體外轉(zhuǎn)換，即在二者之Navagen公司用T7噬菌體構(gòu)建的各種cDNA表達文庫，將外源基因序列插入到編碼T7噬菌體包膜蛋白基因中所表達的多肽或蛋白質(zhì)以與噬菌體包膜蛋白融合的形式展示在噬菌體表面。T7噬菌體展示文庫可以展示相當部分表達的蛋白質(zhì)，甚至可以保持蛋白的一定構(gòu)象。因此，該系統(tǒng)最大程度地再現(xiàn)了細胞內(nèi)的真實情況，所篩選出的結(jié)合蛋白與自然狀態(tài)較為接近。目前已被成功應用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、抗原-抗體以及DNA-蛋白質(zhì)之間作用的研究，為功能基因組學的研究提供了一種新的方法。

50ppt課件.Navagen公司用T7噬菌體構(gòu)建的各種cDNA表達文庫，將cDNA庫是在噬菌體衣殼蛋白的基因中插入從某些組織或細胞中抽提出來的mRNA的互補DNA片段，從而表達該組織或細胞的各種蛋白于噬菌體的表面。

如：抗體庫的構(gòu)建

51ppt課件.cDNA庫是在噬菌體衣殼蛋白的基因中插入從某些組織或細胞中抽表達載體噬菌粒pCANTAB5E52ppt課件.表達載體噬菌粒pCANTAB5E18ppt課件.噬菌體展示技術(shù)的應用1.與蛋白質(zhì)相互作用的研究

有研究利用T7噬菌體展示篩選系統(tǒng)，以絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路中p38作為靶蛋白，篩選了與其有結(jié)合關(guān)系的多肽或蛋白，得到了46個編碼蛋白的序列，在這些蛋白中有激酶、轉(zhuǎn)錄因子、細胞骨架相關(guān)蛋白和離子通道相關(guān)蛋白等。

53ppt課件.噬菌體展示技術(shù)的應用1.與蛋白質(zhì)相互作用的研究19ppt2.在篩選和制備多肽藥物方面的研究及應用隨機噬菌體展示多肽文庫：一組隨機編碼序列或基因群插入噬菌體載體進行表達及展示時,就形成噬菌體展示文庫，在文庫中,每個噬菌體粒子只展示一種序列的外源肽鏈,不同噬菌體粒子展示不同序列的外源肽鏈。用一定功能的靶分子篩選，可以簡便快速地獲得與靶分子具有強親和力和特異性的小肽或新型蛋白，這些肽段可以作為侯選藥物進行開發(fā)。54ppt課件.2.在篩選和制備多肽藥物方面的研究及應用20ppt課件.

3在疾病的治療和致病機理方面的研究

有研究以HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A作為固相靶分子，用T7噬菌體表面展示的人肝細胞cDNA文庫進行5輪篩選后，確定了與HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A結(jié)合的是肝細胞蛋白絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）激活蛋白激酶5（MAPKAPK5），為進一步研究HCV的致病機制奠定了基礎(chǔ)。

55ppt課件.3在疾病的治療和致病機理方面的研究21ppt課件.酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交技術(shù)由Fields等人于1989年提出。該技術(shù)利用了酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)，GAL4包括兩個彼此分離但功能上必需的結(jié)構(gòu)域,一個是位于N端1-174位氨基酸殘基區(qū)段的DNA結(jié)合(DNAbindingdomain,DNA-BD),另一個是位于C端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(Activationdomain,AD）。56ppt課件.酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交技術(shù)由Fields等人于1989年DNA-BD能夠識別GAL4效應基因的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS),并與之結(jié)合，而AD則通過與轉(zhuǎn)錄機制中的其他成分之間的作用,啟動UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。DNA-BD和AD單獨作用均不能激活轉(zhuǎn)錄反應,只有當二者在空間上充分接近并呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性時,方可激活UAS下游啟動。57ppt課件.DNA-BD能夠識別GAL4效應基因的上游激活序列(Up該系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄激活的條件是蛋白質(zhì)作為一個整體起作用。分別經(jīng)分子克隆技術(shù)在同一細胞中表達的BD和AD多肽不會彼此間發(fā)生作用，BD和AD分別可以同其他蛋白質(zhì)X或Y結(jié)合形成融合蛋白,如果X，Y之間可以形成蛋白-蛋白復合物,使GAL4兩個結(jié)構(gòu)域重新構(gòu)成AD和BD成為一體,就可以啟動特異基因序列的轉(zhuǎn)錄。58ppt課件.該系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄激活的條件是蛋白質(zhì)作為一個整體起作用。24pptGAL4重建后激活轉(zhuǎn)錄模式圖BDADXYUAS報告基因（LacZ）59ppt課件.GAL4重建后激活轉(zhuǎn)錄模式圖BDADXYUAS報告基因（一般地,將BD-X的融合蛋白稱作誘餌(bait),X往往是已知蛋白,AD-Y稱作獵物(prey),能顯示誘餌和獵物相互作用的基因稱報告基因,通過對報告基因的檢測,反過來可判斷誘餌和獵物之間是否存在相互作用。60ppt課件.一般地,將BD-X的融合蛋白稱作誘餌(bait),X往往是

作為一種分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的簡便而有效的研究體系,酵母雙雜交的最大的優(yōu)點是不需要分離、純化蛋白質(zhì),整個過程只是對核酸進行操作