NGS系列講座-NGS基本原理課件

NGS系列講座（一）——

NGS簡介及原理2017/06/01魏冬凱NGS系列講座（一）——

NGS簡介及原理2017/06/0Outline二代測序技術(shù)背景Solexa測序原理Outline二代測序技術(shù)背景Outline二代測序技術(shù)背景Solexa測序原理其他平臺測序技術(shù)簡介Outline二代測序技術(shù)背景什么是DNA測序？測序的研究對象是什么？DNA測序（DNAsequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。

——百度百科測序主要研究的是DNA一級結(jié)構(gòu)，不涉及DNA的二級、三級結(jié)構(gòu)什么是DNA測序？測序的研究對象是什么？DNA測序（DNADNA合成的基本過程dNTPddNTPDNA合成的基本過程dNTPddNTP一代測序末端終止法（ABI3700）使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用熒光染料標(biāo)記4種不同的堿基，通過計(jì)算機(jī)自動讀出。Frederick“Fred”Sanger一代測序Frederick“Fred”SangerSanger測序5’TGCGCGGCCCAPrimerACGCGCCGGGT???????????????5’3’Sanger測序5’TGCGCGGCCCSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCTSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序GTCTTGGGCTAGCGCACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bpSanger測序GTCTTGGGCTASanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCTASanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAGTCTT16bpSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGT???????????????5’3’??????????????C5’TGCGCGGCCCA?????????T5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCA??????????A22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCA????????C20bp5’TGCGCGGCCCA????T16bpSanger測序ACGCGCCGGGT5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGG19bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bpSanger測序GTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGT13bp5’TGCGCGGCCCAGTCTT16bp5’TGCGCGGCCCAGTC14bp5’TGCGCGGCCCAGTCT15bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTG17bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGG18bpLaserReader5’TGCGCGGCCCAGTCTSanger測序Sanger測序Sanger測序的特點(diǎn)測序長度500-1000bp。通量低，每次測序最多獲得1kb數(shù)據(jù)，如果測大基因組，成本極高。錯(cuò)誤率高，PCR帶來錯(cuò)配。測序基于PCR反應(yīng)，需要引物，并且有些些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進(jìn)行PCR反應(yīng)的片段不能測序。Sanger測序的特點(diǎn)測序長度500-1000bp。1990年10月美國確定把當(dāng)年的10月1日作為官方實(shí)施HGP的起始日期，被譽(yù)為生命科學(xué)“阿波羅登月計(jì)劃”的國際人類基因組計(jì)劃啟動。2000年完成草圖，2003年正式完成。全部人類基因組約有2.91Gbp，約有39000多個(gè)基因。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個(gè)功能基因。耗時(shí)13年，30億美金。人類基因組計(jì)劃（HGP）1990年10月美國確定把當(dāng)年的10月1日作為1977年2005年Roche4542006年IlluminaGA2007年ABIsolid2008年Helicos

單分子測序儀2009年P(guān)acific

單分子測序儀第一代第二代第三代二代測序技術(shù)的出現(xiàn)1977年2005年Roche4542006年Illumi鳥槍法基因組基因組片段鳥槍法基因組基因組片段鳥槍法基因組片段通過剪切力，超聲，酶切等打斷基因組鳥槍法基因組片段通過剪切力，超聲，酶切等打斷基因組ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGT17bp66bp基本測序思路ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基因組:基本測序思路ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基因組:基本測序思路ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGOutline二代測序技術(shù)背景Solexa測序原理其他二代測序平臺技術(shù)簡介Outline二代測序技術(shù)背景Solexa測序的關(guān)鍵技術(shù)（Illumina）橋式PCR(Solid-phasebridgeamplification)Solexa測序的關(guān)鍵技術(shù)（Illumina）橋式PCROPPPHNNOO熒光基團(tuán)3’保護(hù)基團(tuán)Nextcycle摻入檢測去保護(hù)基團(tuán)去熒光基團(tuán)ODNAHNNOO3’O5’游離3‘末端XOH4種標(biāo)記過的核苷酸可逆終止反應(yīng)

ReversibleTerminatorChemistrySolexa測序的關(guān)鍵技術(shù)（Illumina）OPPPHNNOO熒光基團(tuán)3’保護(hù)基團(tuán)Nextcycl橋式PCR橋式PCR準(zhǔn)備DNA片段兩端接上adapters橋式PCR準(zhǔn)備DNA片段兩端接上adapters橋式PCR準(zhǔn)備DNA片段兩端接上adapters將DNA片段通過adapter錨定在芯片上循環(huán)擴(kuò)增DNA片段成“DNA簇”20micronsSequence橋式PCR準(zhǔn)備DNA片段兩端接上adapters將DNA片段通過adCAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’ FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents DetectSignal CleaveTerminatorandDyeCycle2-n:Addsequencingreagentsandrepeat邊合成邊測序(SequencingBySynthesis)CAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTSBS123789456TTTTTTT

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T…根據(jù)每個(gè)DNA簇每輪反應(yīng)讀取的熒光信號序列，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA序列SBS123789456TTTTTTTGTSolexa測序原理Solexa測序原理測序種類Single-ReadSequencing(SR)測序種類Single-ReadSequencing(SR)測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)測序種類Single-ReadSequencing(SR)測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)測序種類Single-ReadSequencing(SR)測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)測序種類Single-ReadSequencing(SR)測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)測序種類Single-ReadSequencing(SR)測序種類Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)√測序種類Single-ReadSequencing(SR)QuestionQuestion謝謝！謝謝！NGS系列講座（一）——

NGS簡介及原理2017/06/01魏冬凱NGS系列講座（一）——

NGS簡介及原理2017/06/0Outline二代測序技術(shù)背景Solexa測序原理Outline二代測序技術(shù)背景Outline二代測序技術(shù)背景Solexa測序原理其他平臺測序技術(shù)簡介Outline二代測序技術(shù)背景什么是DNA測序？測序的研究對象是什么？DNA測序（DNAsequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。

——百度百科測序主要研究的是DNA一級結(jié)構(gòu)，不涉及DNA的二級、三級結(jié)構(gòu)什么是DNA測序？測序的研究對象是什么？DNA測序（DNADNA合成的基本過程dNTPddNTPDNA合成的基本過程dNTPddNTP一代測序末端終止法（ABI3700）使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用熒光染料標(biāo)記4種不同的堿基，通過計(jì)算機(jī)自動讀出。Frederick“Fred”Sanger一代測序Frederick“Fred”SangerSanger測序5’TGCGCGGCCCAPrimerACGCGCCGGGT???????????????5’3’Sanger測序5’TGCGCGGCCCSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCTSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序GTCTTGGGCTAGCGCACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bpSanger測序GTCTTGGGCTASanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCTASanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAGTCTT16bpSanger測序ACGCGCCGGGTSanger測序ACGCGCCGGGT???????????????5’3’??????????????C5’TGCGCGGCCCA?????????T5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCA??????????A22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCA????????C20bp5’TGCGCGGCCCA????T16bpSanger測序ACGCGCCGGGT5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGG19bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bpSanger測序GTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGT13bp5’TGCGCGGCCCAGTCTT16bp5’TGCGCGGCCCAGTC14bp5’TGCGCGGCCCAGTCT15bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTG17bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGG18bpLaserReader5’TGCGCGGCCCAGTCTSanger測序Sanger測序Sanger測序的特點(diǎn)測序長度500-1000bp。通量低，每次測序最多獲得1kb數(shù)據(jù)，如果測大基因組，成本極高。錯(cuò)誤率高，PCR帶來錯(cuò)配。測序基于PCR反應(yīng)，需要引物，并且有些些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進(jìn)行PCR反應(yīng)的片段不能測序。Sanger測序的特點(diǎn)測序長度500-1000bp。1990年10月美國確定把當(dāng)年的10月1日作為官方實(shí)施HGP的起始日期，被譽(yù)為生命科學(xué)“阿波羅登月計(jì)劃”的國際人類基因組計(jì)劃啟動。2000年完成草圖，2003年正式完成。全部人類基因組約有2.91Gbp，約有39000多個(gè)基因。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個(gè)功能基因。耗時(shí)13年，30億美金。人類基因組計(jì)劃（HGP）1990年10月美國確定把當(dāng)年的10月1日作為1977年2005年Roche4542006年IlluminaGA2007年ABIsolid2008年Helicos

單分子測序儀2009年P(guān)acific

單分子測序儀第一代第二代第三代二代測序技術(shù)的出現(xiàn)1977年2005年Roche4542006年Illumi鳥槍法基因組基因組片段鳥槍法基因組基因組片段鳥槍法基因組片段通過剪切力，超聲，酶切等打斷基因組鳥槍法基因組片段通過剪切力，超聲，酶切等打斷基因組ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGT17bp66bp基本測序思路ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基因組:基本測序思路ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基因組:基本測序思路ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGOutline二代測序技術(shù)背景Solexa測序原理其他二代測序平臺技術(shù)簡介Outline二代測序技術(shù)背景Solexa測序的關(guān)鍵技術(shù)（Illumina）橋式PCR(Solid-phasebridgeamplification)Solexa測序的關(guān)鍵技術(shù)（Illumina）橋式PCROPPPHNNOO熒光基團(tuán)3’保護(hù)基團(tuán)Nextcycle摻入檢測去保護(hù)基團(tuán)去熒光基團(tuán)ODNA