2. 檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基

實驗一雙酶法制備淀粉糖綜合實驗一面包酵母高

密度發(fā)酵實驗實驗一雙酶法制備淀粉糖一、實驗目的1、了解淀粉糊化及酶法制備淀粉糖漿的基本原理。2、掌握淀粉雙酶法制備淀粉糖漿的實驗方法，以及酶的使用。淀粉的組成由D-葡萄糖單體組成的同聚物。包括直鏈淀粉（α-1,4-糖苷鍵）和支鏈淀粉兩種類型。（α-1,4-糖苷鍵，α-1,6-糖苷鍵

）

淀粉顆粒麥芽、輔料中的淀粉，一般由細胞壁包圍，以顆粒狀存在。這種顆粒不溶于水，也不受淀粉酶的作用。PotatostarchWheatstarch糖化中的淀粉分解

淀粉的糊化、液化、糖化糊化是指淀粉在熱水中能吸收水分而膨脹，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成帶有粘性的淀粉糊，這一過程稱為糊化。簡而言之，糊化就是淀粉顆粒在熱溶液中膨脹破裂的過程。液化是指利用液化酶將糊化淀粉水解成糊精和低聚糖小分子等，使粘度降低，流動性增高。糖化是指利用利用糖化酶將糊精或低聚糖進一步水解，轉變?yōu)槠咸烟堑倪^程，在生產上稱為“糖化”。DE值DE值即葡萄糖值，用以表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是葡萄糖占干物質的百分率，即：二、實驗原理——淀粉的糖化許多微生物不能直接利用淀粉，除分泌胞外淀粉酶微生物外。淀粉水解葡萄糖，才能被酵母菌利用。酸解法酶解法酸酶（或酶酸）結合法酸酶法酶酸法淀粉糖化的方法1.酸解法淀粉酸高溫高壓葡萄糖2.酶解法（雙酶法）淀粉a-淀粉酶糊精和低聚糖糖化酶葡萄糖(液化)（糖化）

3.酸酶法淀粉酸解法糊精和低聚糖糖化酶葡萄糖4.酶酸法淀粉a-淀粉酶糊精和低聚糖酸解法葡萄糖雙酶法制備淀粉糖酶法糖化投資少，工藝穩(wěn)定，對設備要求也不高，產品質量好，消耗小，收率高，條件溫和，對環(huán)境影響小。

三、試驗材料

玉米淀粉、液化型α-淀粉酶（酶活力6000單位/g），糖化酶（葡萄糖淀粉酶、酶活力為4-5萬單位/g），10%NaOH,5%Na2CO3,5%CaCl2。500ml燒杯，pH試紙、秒表，玻璃棒，恒溫水浴鍋，電爐，石棉網、溫度計、恒溫水浴、手持糖度儀（可溶性固形物）。四、方法和步驟1、雙酶法生產淀粉糖漿工藝流程50g淀粉（加水200ml，攪拌均勻）——淀粉漿——5%碳酸鈉調節(jié)pH≈6.2-6.3——2ml5%CaCl2溶液——90-95℃水浴上加熱（不斷攪拌）——淀粉糊化——加入液化型α-淀粉酶60mg（不斷攪拌）——液化——70-80℃攪拌20分鐘，（取樣分析DE值——至電爐（隔石棉網）加熱到95℃至沸，滅活10分鐘——過濾，濾液冷卻至55℃——加入糖化酶200mg——調節(jié)pH≈4.5,于60-65℃恒溫水浴中糖化3-4小時，（3小時取樣分析控制DE≈42）即為淀粉糖漿。2、檢測用手持糖度計測定，直接讀取固形物含量。（3）糖化過程中DE值的變化實驗二、面包酵母活化和種子液培養(yǎng)試驗材料

面包酵母、葡萄糖、酵母浸膏、牛肉膏、氯化鈉、試管（10×150mm）、培養(yǎng)皿、燒杯（500mL）、錐形瓶（300mL）、接種環(huán)、酒精燈、牛皮紙、pH試紙、恒溫搖床、培養(yǎng)箱、離心機、生物安全柜、血球計數板、光學顯微鏡、蓋玻片配制培養(yǎng)基（1）制備平板分離培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，瓊脂20g，水1000mL。滅菌115℃，20min。每三角瓶分裝100mL，滅菌后倒平板。（2）制備斜面保藏培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，瓊脂20g，水1000mL。滅菌115℃，20min。每試管分裝5mL，滅菌后擺斜面待用。（3）制備種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g,水1000mL。滅菌115℃，20min。每三角瓶分裝30mL，滅菌待用。1.稱量

按照培養(yǎng)基配方，準確稱量各成份放于瓷缸中。配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,瓊脂20.0g,蒸餾水1000ml,pH7.0。培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基的制備過程

稱量---溶解----調節(jié)pH值----過濾----分裝及包扎----滅菌----滅菌后試管擺放斜面2.溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，攪拌，加熱使其溶解。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂的熔化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補足所失水分。3.調節(jié)pH值用玻璃棒沾少許液體，測量PH值。用氫氧化鈉和鹽酸調節(jié)PH。4.過濾

用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求可省去。5.分裝及包扎根據不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內（用分裝漏斗）或三角瓶內，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮紙將棉塞部分包好。6.滅菌：高壓蒸汽滅菌，1210C滅菌20分鐘。7.滅菌后試管擺放斜面注意事項1、稱取藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；2、蛋白胨極易吸濕，稱取時動作要迅速；2、配制固體培養(yǎng)基時，先將其他藥品加熱溶解到快沸時，再將稱好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱至瓊脂完全熔化，此過程要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢；4、分裝量根據試管大小和實際需要而定，固體培養(yǎng)基裝量約為管高的1/5，液體培養(yǎng)基的裝量約為管高的1/4，三角瓶的裝量不超過瓶體的1/2；5、分裝過程中注意不要將培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。返回2、平板分離稱取0.1g即發(fā)性干酵母，轉移至無菌水試管，振蕩5min，制成菌懸液。劃平板，30℃培養(yǎng)2d。用接種環(huán)沾取單菌落，劃斜面，30℃培養(yǎng)30h。3、種子培養(yǎng)無菌條件下，用接種環(huán)挑取斜面上菌落，接種至種子培養(yǎng)基。30℃，150r/min，培養(yǎng)30h。血球計數板測種子培養(yǎng)液中酵母菌體密度。（三）平板劃線分離法交叉劃線法連續(xù)劃線法（一）實驗目的（二）實驗原理（三）實驗器材（四）實驗方法（五）實驗作業(yè)微生物數量的測定實驗二（一）實驗目的1、了解顯微鏡計數的原理；2、學習并掌握使用血球計數板進行微生物直接計數的方法。（二）實驗原理

利用血球計數板在顯微鏡下直接計數，是微生物實驗中一種十分重要的常用微生物計數方法。此法的優(yōu)點是直觀、快速，不論微生物的生理狀況如何，都可以在顯微鏡下一一計數。由于此法得到的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計數法。

血球計數板是一塊特制的載玻片，其上四條縱槽構成了三個平臺，中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分成9個大方格，中央的大方格為計數室。計數室邊長1mm，共有400個小方格，加蓋玻片于突起部分上時，即形成一個體積為0.1mm3的計數室。即1mm×1mm×0.1mm方格的計數板。

在血球計數板上，刻有一些符號和數字(見圖一)，其含義是：XB-K-25為計數板的型號和規(guī)格，表示此計數板分25個中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計數室的高；1/400mm2表示計數室面積是1mm2，分400個小格，每小格面積是1/400mm2。計數室通常也有兩種規(guī)格：一種是16×25型，即大方格內分為16中格，每一中格又分為25小格；另一種是25×16型，即大方格內分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數室是哪一種構造，它們都有一個共同的特點，即每一大方格都是由16×25=25×16=400個小方格組成。1．16×25型的計數板含16中格，每中格有25個小格，一般取四角：1、4、13、16四個中方格（含100個小方格）計數計數重復3次，取其平均值。1ml菌液中的總菌數=100個小方格細胞總數A/100×400×10×

1000×稀釋倍數B，或計數總數A／4×16×10×1000×稀釋倍數B。即計數總數A×4×10000×稀釋倍數B2．25×16型的計數板含25中格，每中格有16個小格。一般計數四個角和中央（1、5、13、21、25）的五個中方格（含80個小方格）的細胞數。計數重復3次，取其平均值。1ml菌液中的總菌數＝80個小方格細胞總數A/80×400×10×1000

×稀釋倍數B，或計數總數A／5×25×10×1000×稀釋倍數B。即計數總數A×5×10000×稀釋倍數B（三）實驗器材1.菌種

釀酒酵母（Saccharomyces

cerevisiae）菌懸液2.器具

顯微鏡、血球計數板、酒精燈、接種環(huán)、無菌水、吸管、蓋玻片、計數器。（四）實驗方法1.稀釋

將釀酒酵母菌懸液進行適當稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2.鏡檢計數室

在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數。

3．加樣品

將清潔干燥的血球計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的細口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多）讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產生。4.顯微鏡計數

靜置幾分鐘，將計數板放在顯微鏡下，先用低倍鏡找到計數室，再換成高倍鏡進行計數，一般以每小格5—10個菌體為宜；每個計數室選右上右下、左上左下和中間的五個中方格中的菌體進行計數，每個樣品重復計數兩次5.清洗血球計數板

計數完畢，將計數板在水龍頭下沖洗干凈后自行晾干或用吹風機吹干，鏡檢觀察每小格內無殘留物為止。

注意事項1、每天同一時間，各組取出本組的試管，用血球計數板計數酵母菌個數，并作記錄，連續(xù)觀察7天。2、從試管中吸出培養(yǎng)液進行計數之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計數的代表性和準確性，求得的培養(yǎng)液中的酵母菌數量誤差小。1、加樣時先搖勻菌液，計數室中不可有氣泡產生；3、如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，作為兩個菌體計算；4、清洗計數板時切勿用手或硬物刷洗。5、對于壓在方格界線上的酵母菌應當計數同側相鄰兩邊上的菌體數，一般可采取“數上線不數下線，數左線不數右線”的原則處理，另兩邊不計數。計數時，如果使用16格×25格規(guī)格的計數室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個中格(即100個小格)的酵母菌數；如果規(guī)格為25格×16格的計數板，除了取其4個對角方位外，還需再數中央的一個中格(即80個小方格)的酵母菌數。6、計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算，對每個樣品可計數三次，再取其平均值。計數時應不時調節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體。按公式計算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌個數。

計數室各格中菌數

總菌數

稀釋度菌數/ml平均值12345第一室第二室顯微直接計數結果(五)、作業(yè)思考題：

1.用血球計數板計數時，哪些步驟易造成誤差？

2.血球計數板測定原理是什么？它有那些原理？實驗三面包酵母高密度發(fā)酵一、實驗目的1、掌握面包酵母的發(fā)酵流程。二、實驗原理

酵母高密度發(fā)酵技術是一種新型的生化工程技術，其產品在化工，食品，環(huán)保，醫(yī)藥等方面都存在極大的潛在能力。一般認為發(fā)酵液中酵母干重濃度達到30g/L以上，即為高密度發(fā)酵。三、試驗材料

面包酵母、葡萄糖、酵母浸膏、牛肉膏、氯化鈉、試管（10×150mm）、燒杯（500mL）、錐形瓶（300mL）、涂布棒、酒精燈、牛皮紙、pH試紙、恒溫搖床、培養(yǎng)箱、離心機、生物安全柜、血球計數板、光學顯微鏡發(fā)酵培養(yǎng)基:

酪蛋白胨15g/L,酵母粉25g/L,葡萄糖30g/L,KH2PO42.4g/L,K2HPO4·3H2O16.34g/L高密度培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖75g/L，酵母浸膏33g/L，蛋白胨16g/L，硫酸鎂1.0g/L，K2HPO4·3H2O

3.4g/L，甘氨酸2g/L高壓蒸汽滅菌，1210C滅菌20分鐘。高壓滅菌鍋壓強指示指到0時才能打開滅菌鍋。四、實驗步驟

菌粉----分離純化-----斜面保藏菌種------種子培養(yǎng)-----發(fā)酵培養(yǎng)（發(fā)酵培養(yǎng)基、高密度培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基）1、取300mL錐形瓶，加入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌待用。2、種子液稀釋10-3倍后，血球計數板計數。3、將種子液接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，控制接種量使菌液初始細胞密度為5×105/mL。4、30℃、150r/min培養(yǎng)，每隔12h取樣測定。五、結果與討論實驗四活性干酵母的制備一、實驗目的1、掌握酵母細胞的一般提取方法、以及活性干酵母的制備方法。二、實驗原理

發(fā)酵液的后處理包括離心、濃縮、洗滌、壓榨或過濾。濾餅可擠壓成半固體酵母塊(含固形物30%),包裝后作為鮮酵母使用。如果生產活性干酵母,可將壓榨酵母擠壓成細條狀,采用快速低溫干燥。在干燥過程中使用添加劑,以生產出穩(wěn)定性極好的低水分的活性干酵母,而且減少活性的損失?；钚愿山湍负绦挝锎蠹s為95%。對面包酵母培育的結果應使其色澤淺,富有生鮮氣味。菌體細胞應各自分開,大小均一。三、試驗材料

脫水山梨醇單硬脂酸甘油酯

(乳化劑)離心管、燒杯。恒溫搖床、培養(yǎng)箱、離心機、生物安全柜、血球計數板（全班4塊）、光學顯微鏡（全班兩臺）、濾紙四、實驗步驟

1、乳化劑用80～90℃的熱水配制,可按每100mL水里加12.5g配制,配好后保持65～70℃,在抽濾之前加入酵母乳中(加入的百分比為酵母乳折干后的百分比)，采用2.0%的添加量并保證混合均勻。2、將發(fā)酵液離心并收集菌體，按上述比例加入乳化劑，抽濾后，切成小細條干燥（10oC烘箱烘干），收集后稱重（干酵母凈重=烘干后總重-烘干前濾紙重）。五、結果與討論

1、活性干酵母成品的質量。2、活性干酵母的外觀特征。六、思考題1、加入乳化劑的目的？檸檬酸發(fā)酵預實驗一、預備實驗：1.斜面培養(yǎng)基制備：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂，PotatoDextroseAgar（Medium））：（馬鈴薯200克葡萄糖20克瓊脂15~20克自來水1000毫升自然PH）。取PDA培養(yǎng)基粉約43g，加水至1000mL；121℃滅菌20min。

2.

檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基：硝酸銨2.0g，KH2P041.0g，MgS040.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／LNaOH約2滴。取100ml上述培養(yǎng)液，加入500ml或300ml三角瓶中，包扎滅菌，待用。

1．菌種活化與種子的制備菌種活化：對于已長久保存的菌種，需經斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)一次，即取保存的斜面菌種黑曲霉，移至斜面培養(yǎng)基，經25~28℃斜面培養(yǎng)至孢子長好，作為活化后的種子（由實驗員準備）。發(fā)酵用的種子制備：用同樣方法，移接斜面培養(yǎng)基，得到的培養(yǎng)物作為發(fā)酵用的種子。2．接種與發(fā)酵

取檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基（液）3瓶，用接種環(huán)向每瓶接入黑曲霉孢子2~3環(huán)，26~28℃搖床培養(yǎng)5~7d，搖床轉速120~150rpm，另1瓶不接種留作對照。今天實驗安排1.配檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基，每組400ml，分裝4瓶，滅菌備用。2.酵母發(fā)酵培養(yǎng)和高密度發(fā)酵培養(yǎng)細菌密度（2組合用一組樣品，分別測發(fā)酵和高密度發(fā)酵培養(yǎng)結果）、離心測上清液葡萄糖濃度（各組用自己的樣品）。3.酵母離心收集、加乳化劑、抽濾、干燥、稱重。4.接種黑曲霉孢子至檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基（3瓶接種，1瓶不接種留做對照）。綜合實驗二檸檬酸發(fā)酵實驗一些檸檬酸制品1.物理性質在室溫下，檸檬酸為無色半透明晶體或白色顆?；虬咨Y晶性粉末，無臭、味極酸，在潮濕的空氣中微有潮解性。它可以以無水合物或者一水合物的形式存在：檸檬酸從熱水中結晶時，生成無水合物；在冷水中結晶則生成一水合物。加熱到78°C時一水合物會分解得到無水合物。在15攝氏度時，檸檬酸也可在無水乙醇中溶解。檸檬酸結晶形態(tài)因結晶條件不同而不同，有無水檸檬酸C6H8O7也有含結晶水的檸檬酸2C6H8O7.H2O、C6H8O7.H2O或C6H8O7.2H2O。2.化學性質

化學性質：從結構上講檸檬酸是一種三羧酸類化合物，并因此而與其他羧酸有相似的物理和化學性質。加熱至175°C時它會分解產生二氧化碳和水，剩余一些白色晶體。檸檬酸是一種較強的有機酸，有3個H+可以電離；加熱可以分解成多種產物，與酸、堿、甘油等發(fā)生反應。中文名稱：

檸檬酸（

citricacid）化學名稱：

2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸分子式：

C6H8O7

檸檬酸發(fā)酵微生物

1)

黑曲霉（Aspergillus

niger）的形態(tài)特征

2)

黑曲霉（Aspergillus

niger）的生理特征

黑曲霉生產菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麥芽糖、糊精、乳糖等培養(yǎng)基上生長、產酸。黑曲霉以無性生殖的形式繁殖，具有多種活力較強的酶系，能利用淀粉類物質，并且對蛋白質、單寧、纖維素、果膠等具有一定的分解能力。一、實驗目的1、了解利用黑曲霉生產檸檬酸的原理與流程，掌握檸檬酸的發(fā)酵生產工藝與發(fā)酵分析方法。2、通過本實驗能較熟練地掌握真菌發(fā)酵的接種、培養(yǎng)與發(fā)酵產物的分析測定等技術。二、實驗原理黑曲霉產檸檬酸多，耐酸力強；pH1.6~1.7時尚能生長，且酸度大時產生葡萄糖酸、草酸等副產物較少，故進行檸檬酸發(fā)酵時，培養(yǎng)液以pH2~3為宜。用于檸檬酸生產的原料有淀粉、廢糖蜜等；本實驗以糖等為發(fā)酵原料，黑曲霉為產生菌。在一般發(fā)酵中，均產生多種酸，其中，低碳鏈的直鏈脂肪酸如甲酸、乙酸等稱為揮發(fā)酸，而乳酸、檸檬酸等稱為非揮發(fā)酸。揮發(fā)酸和非揮發(fā)酸的總和稱總酸。酸的測定方法常采用中和法、電位滴定法及比色法等；若待測液色澤很深，可采用外指示劑法。本試驗用中和法測定檸檬酸發(fā)酵中的總酸；檸檬酸的定性檢驗用Deniges試劑。三、試驗材料

1．菌種

黑曲霉斜面菌種

2．實驗器材

0.1mol／L標準NaOH；0.1mol／LH2S04；展開劑：正丁醇：甲酸：水=40：55：5；

Deniges試劑(HgO1g溶于20ml0.2mol／LH2S04中)；酒精燈；濾紙，漏斗；燒杯：200ml，500ml；

18X180試管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；

堿滴定管，鐵臺、蝴蝶夾：酚酞指示劑：200ml量筒；廣范pH試紙；pH酸度計；玻璃棒；布氏漏斗，抽濾紙，抽濾水泵，離心機和離心管，滴管，天平。層析缸（?10cm×15cm）、毛細管(?0.5mm)、玻棒、噴霧器、烘箱、尺、鉛筆、干燥器，等。3.

檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基：硝酸銨2.0g，KH2P041.0g，MgS040.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／LNaOH約2滴。取100ml上述培養(yǎng)液，加入500ml或300ml三角瓶中，包扎滅菌，待用。四、方法和步驟一、預備實驗：1.斜面培養(yǎng)基制備：可用PDA培養(yǎng)基或其它霉菌培養(yǎng)基，用于霉菌的培養(yǎng)。2.發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：參見實驗器材中的檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基及其制作方法。

二、具體步驟

1．菌種活化與種子的制備菌種活化：對于已長久保存的菌種，需經斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)一次，即取保存的斜面菌種黑曲霉，移至斜面培養(yǎng)基，經25~28℃斜面培養(yǎng)至孢子長好，作為活化后的種子（由實驗員準備）。發(fā)酵用的種子制備：用同樣方法，移接斜面培養(yǎng)基，得到的培養(yǎng)物作為發(fā)酵用的種子。2．接種與發(fā)酵

取檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基（液）3瓶，用接種環(huán)向每瓶接入黑曲霉孢子2~3環(huán)，26~28℃搖床培養(yǎng)5~7d，搖床轉速120~150rpm，另1瓶不接種留作對照。注意：觀察細胞生長情況及變化并記錄；觀察發(fā)酵過程中pH的變化并記錄。當pH3左右是積累檸檬酸的最佳時期。。3．發(fā)酵液預處理取發(fā)酵液經過濾

將3瓶培養(yǎng)液一并過濾，菌絲用蒸餾水略加洗滌后棄去。4.發(fā)酵產物的檢驗與分析定性檢驗（略）：取過濾液和對照液各約5ml，放入試管內，加Deniges液lml，在酒精燈上緩緩加熱至沸。逐滴加入20g／LKMn04溶液，若有檸檬酸存在，則出現白色沉淀。紙層析法：展開劑：正丁醇：甲酸：水=40：55：5（V/V/V）；顯色劑：0.25g的甲基紅和0.25g的溴酚藍溶于100mL70%的乙醇中，再用0.1mol/L的NaOH調成藍綠色。層析紙：新華