SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗報告

分子生物學(xué)實驗報告實驗名稱：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

班級：生工xxx姓名：xxx一同組人：xxx

學(xué)號：xxxx

日期：xxxx銀染是迄今為止靈敏度最高的一種染色法。是對SDS凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色時最常用的方法其基本原理是銀離子與蛋白質(zhì)分子上的酸基COO-）結(jié)合,然后銀離子被還原為自由的銀,可使蛋白質(zhì)條帶呈現(xiàn)深棕至黑色。銀染基本上可以分為酸性和堿性2種方法。堿性方法非常敏感,但是需要較長的步驟。酸性方法快速但是靈敏度較低。銀染的優(yōu)點在于靈敏度高,其缺點在于:可能造成很高的背景,特別在水不夠純的情況下；費時費力（需要8?16h）；費用昂貴；需要接觸有毒的甲醛,而且核酸、脂多糖、脂類、醣脂類化合物常會對銀染染色的結(jié)果進(jìn)行干擾。熒光法[3]針對考馬斯亮蘭染色雖然快速但是靈敏度不夠,銀染法雖然靈敏度高但是背景較高,結(jié)果容易受到核酸污染等缺點,人們嘗試用熒光染料對凝膠中的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色。這些熒光染料有Fluoresceinisothiocyanate,dansylchloride,rhodamineisothiocyanate等。這些熒光染色方法需要在電泳之前熒光染料與一定的功能基團(tuán)相結(jié)合。共價結(jié)合的熒光標(biāo)簽在蛋白質(zhì)檢測方面非常敏感,超過了考馬斯亮蘭。4.3.3負(fù)染法[3]負(fù)染的原理主要是有選擇的將金屬離子沉淀在膠上,蛋白質(zhì)條帶不能被染色,因此,它們所處的位置是透明的。這種方法非常簡單快速。但是,這種方法的重復(fù)性依賴于許多物理化學(xué)因素（例如染色液的pH，膠中陰離子的濃度、溫度等）。所以,它不能作為一種通常運用的方法。但是,與其他方法相比,該方法允許蛋白質(zhì)保持完整并有效回收以做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)分析。特別是在運用咪唑鋅進(jìn)行負(fù)染時,凝膠中鋅介導(dǎo)的蛋白質(zhì)固定是完全可以逆轉(zhuǎn)的,洗脫后的蛋白質(zhì)沒有受到化學(xué)修飾,也沒有受到有機(jī)物的污染,咪唑鋅或者改進(jìn)后的咪唑-SDS-鋅染色法靈敏度接近于銀染（1-10ng）,重復(fù)性優(yōu)于用銅或者鋅進(jìn)行的負(fù)染。注意事項制備凝膠應(yīng)選用高純度的試劑，否則會影響凝膠聚合與電泳效果。由于與凝膠聚合有關(guān)的硅橡膠條、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；撥膠時凝膠板易斷裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格的清洗。安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力或用一旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。用瓊脂封底及灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。凝膠完全聚合后，必須放置30min至1h，使其充分老化后才能輕輕取出樣品模槽板，切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區(qū)帶扭曲。為防止電泳后區(qū)帶拖尾，樣品中鹽離子強(qiáng)度應(yīng)盡量低，含鹽量高的樣品可用透析法或凝膠過濾法脫鹽。最大加樣量不得超過100Rg蛋白/100℃比。在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在分離膠聚合后進(jìn)行，洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進(jìn)行預(yù)電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應(yīng)。電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應(yīng)選用合適的電流、電壓，過高或者過低都會影響電泳效果。電泳后，應(yīng)分別收集上下貯槽的電泳緩沖液，在冰箱貯存，可用2－3次。為保證電泳結(jié)果滿意，最好使用新稀釋的緩沖液［2］。5參考文獻(xiàn)［1］李文蓉，許鍵，喻梅輝.幾種SDS蛋白質(zhì)染色方法的比較［口.八一農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1993,16(3):32-35.［2］分子生物學(xué)實驗指導(dǎo).SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳