聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase Chain Reaction (PCR)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PolymeraseChainReaction(PCR)實(shí)驗(yàn)三

實(shí)驗(yàn)原理

PCR技術(shù)類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

實(shí)驗(yàn)材料和試劑引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：引物長(zhǎng)度約為16-30bp，太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高；引物中G+C含量通常為40-60%，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度：Tm＝4(G+C)+2(A+T)；四種堿基隨機(jī)分布，在3’端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)；引物3’端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)，以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)；在引物內(nèi)，尤其在3’端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)；兩引物之間尤其在3’端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性；引物5’端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等。通常應(yīng)在5’端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基；引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無(wú)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量。4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應(yīng)用NaOH將pH調(diào)至7.0，并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4種dNTP各20μmol/L,足以在100μL反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入；Mg2+：Mg2+濃度對(duì)TaqDNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實(shí)性,影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/L。對(duì)于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)，例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+離子濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+濃度；

模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。模板量過(guò)多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率；TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期為92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30min，摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4

核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意。在100μLPCR反應(yīng)中，1.5-2單位的TaqDNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán)。所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過(guò)多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過(guò)少則使產(chǎn)量降低；反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/LTris?Cl(20℃下pH8.3-8.8)，50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度的Mg2+。Tris?Cl在20℃時(shí)pH為8.3-8.8，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中,pH為6.8-7.8，50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA片段有利。各種TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀PCR擴(kuò)增體系（以50μL為例）依次混勻下列試劑35μL

H2O5μL

10×PCR反應(yīng)緩沖液4μL25mmol/LMgCl24μL

4種dNTP0.5μL上游引物（引物１）0.5μL

下游引物（引物２）0.5μL

模板DNA

(約1ng)

PCR反應(yīng)條件：94

℃

3min94℃

30sec50℃

30sec72℃

80sec

Cycle4072℃

10min注：根據(jù)實(shí)際情況可調(diào)整退火溫度，變性時(shí)間，退火時(shí)間等參數(shù)PCR反應(yīng)步驟1.按PCR擴(kuò)增體系將反應(yīng)物一一加入，混合均勻。2.根據(jù)計(jì)算好的PCR反應(yīng)條件為實(shí)驗(yàn)用PCR儀設(shè)定反應(yīng)程序。3.反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度。4.PCR產(chǎn)物的純化（酚/氯仿法）取反應(yīng)產(chǎn)物加100μLTE。加等體積氯仿混勻后用微型離心機(jī)10000rpm離心15s,

用

移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次,可除去覆蓋在表面的礦物油。再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次,

每次回收上層水相。在水相中加300μL95％乙醇,

置-20℃下30min沉淀。在小離心機(jī)上10000rpm離心10min,吸凈上清液。加入1mL70％乙醇，稍離后,吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7mLddH2O中，待用。

示例電泳結(jié)果

12345MM：DNAmarker1：為陽(yáng)性對(duì)照2：為陰性對(duì)照3-5：為擴(kuò)增出的DNA條帶實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專(zhuān)門(mén)處理后才能清洗。沾染了EB的實(shí)驗(yàn)垃圾需專(zhuān)門(mén)回收處理。觀察DNA離不開(kāi)紫外透射儀，可是紫外光對(duì)DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí)，應(yīng)盡量