染色質(zhì)免疫沉淀技

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)

ChromatinImmunoprecipitation（ChIP）實(shí)驗(yàn)介紹染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)是用于研究在體（細(xì)胞水平）的蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）與DNA（即下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)）的相互作用。其特點(diǎn)是研究體內(nèi)正在發(fā)生作用的蛋白質(zhì)與DNA相互作用，這是和ＥＭＳＡ的區(qū)別。ＣｈＩＰ是由尚永豐教授于２０００年首先創(chuàng)立的，它是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)與ＤＮＡ（多數(shù)是啟動(dòng)子）之間存在結(jié)合作用，由于缺乏（尤其在活體情況下）檢測(cè)這種技術(shù)，尚教授結(jié)合免疫沉淀和定量ＰＣＲ兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)從而產(chǎn)生ChIP技術(shù)。該技術(shù)不僅可以鑒定出某轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的直接和間接結(jié)合作用，而且可以半定量測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的豐度。利用ChIP衍生技術(shù)，可以檢測(cè)在某一特異啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用（RE-ChIP），可以檢測(cè)有RNA剪接作用的蛋白質(zhì)與mRNA的結(jié)合作用（RNAImmunoprecipitation），還可以篩選某些特異的啟動(dòng)子序列（ChIPonChIP）ChIP基本原理首先用甲醛固定活細(xì)胞（37度，10分鐘），生理狀態(tài)結(jié)合的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物呈交聯(lián)狀態(tài)，不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞裂解、超聲和沉淀等步驟被破壞；超聲將DNA打斷成一定大小的片段；用目的蛋白質(zhì)特異性抗體免疫沉淀該蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物；65度解交聯(lián)，分離純化DNA；用針對(duì)某DNA片段設(shè)計(jì)的引物對(duì)該DNA片段進(jìn)行PCR分析；如果PCR擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，則可以說明該蛋白質(zhì)與DNA之間存在相互作用。實(shí)例簡(jiǎn)介用ChIP實(shí)驗(yàn)證明：在乳腺癌細(xì)胞中雌激素與雌激素受體基因啟動(dòng)子結(jié)合（雌激素進(jìn)入胞漿與受體結(jié)合，解離受體+熱休克蛋白復(fù)合體；雌激素+受體復(fù)合物進(jìn)入胞核與雌激素受體基因（PSⅡ）啟動(dòng)子結(jié)合）抗體采用受體蛋白的特異抗體操作步驟1）將細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，用含10%碳素-葡聚糖處理過的胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天后，細(xì)胞長(zhǎng)至95%匯合狀態(tài)，用200nM的雌二醇處理適當(dāng)時(shí)間2）用室溫預(yù)熱的PBS洗細(xì)胞1-2次，然后用1%的福兒馬林（用PBS配制，細(xì)胞在PBS中比較穩(wěn)定）37℃處理10分鐘3）用冰冷的PBS清洗細(xì)胞兩次，然后用細(xì)胞刮子移入１ml冰冷的PBS中,4℃離心3000rpm2min,棄上清。4）用300ul的lysisbuffer重懸細(xì)胞沉淀，冰上孵育10min。5）超聲處理3次，每次15秒，4℃，14000rpm離心10分鐘，收集上清。6）取超聲處理液20ul作為Input組分，加入dilutionbuffer80ul進(jìn)行稀釋。7）剩余的超聲處理液以1：10稀釋，每毫升稀釋液加入20ul正常免疫小鼠血清、蛋白ASepharose4B珠子和鮭精DNA進(jìn)行免疫清洗2小時(shí)，離心取上清。8）加入針對(duì)目的蛋白的特異性抗體，4℃孵育過夜，然后再加入蛋白ASepharose4B珠子和鮭精DNA，孵育1小時(shí)。離心去上清取沉淀。9）依次用TSEⅠ、TSEⅡ、bufferⅢ和TE洗滌免疫復(fù)合物沉淀各1次，每次10分鐘10）用100ulelutionbuffer洗脫珠子上的蛋白-DNA復(fù)合物，室溫，10分鐘11）將洗脫液置于65度水浴中6小時(shí)，以分離蛋白-DNA復(fù)合物。12）分離后的DNA片段經(jīng)過QiaquickPCR提純?cè)噭┖刑峒兒螅?20度保存。13