基因轉(zhuǎn)錄需要DNA依賴性的RNA聚合酶

36.1基因轉(zhuǎn)錄需要DNA依賴性的RNA聚合酶36.2RNA合成涉及三個(gè)過程：起始，延伸和終止36.3一些抗生素是RNA合成的抑制劑。36.4初始RNA轉(zhuǎn)錄物都需經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工36.5核酶是個(gè)位置特異的核酸內(nèi)切酶36.6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控－操縱子模型第36章、RNA合成RNA合成示意圖模板鏈解旋重新纏繞轉(zhuǎn)錄方向編碼鏈轉(zhuǎn)錄泡RNA聚合酶活性部位DNA36.1基因轉(zhuǎn)錄需要DNA依賴性的RNA聚合酶

大腸桿菌RNA聚合酶的核心酶是由5個(gè)蛋白亞基組成的，分別被命名為，ˊ，（2個(gè)），和亞基。其中亞基是催化亞基，核心酶的分子量大約是350000。大腸桿菌RNA聚合酶全酶還含有第六個(gè)亞基，稱之亞基（分子量為70000），與核心的RNA聚合酶瞬時(shí)結(jié)合，其功能是識(shí)別模板上的啟動(dòng)子，使RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合。一旦延伸開始亞基就脫離聚合酶。真核生物存在著三種不同的RNA聚合酶：RNA聚合酶I（RNApolI）、RNA聚合酶II（RNApolII）和RNA聚合酶III（RNApolIII）。每一種聚合酶都含有很多亞基，它們承擔(dān)的任務(wù)各不相同。36.2RNA合成包括三個(gè)階段：起始、延伸和終止起始延伸終止

當(dāng)E.coliRNA聚合酶結(jié)合到模板上的啟動(dòng)子后，就開始了RNA的合成。細(xì)菌啟動(dòng)子要行使其功能需要兩個(gè)高度保守DNA序列，一個(gè)序列區(qū)是處于開始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)核苷酸的5ˊ端之前（習(xí)慣稱之上游）的－35區(qū)，（上游核苷酸編號(hào)為“－”），提供RNA聚合酶識(shí)別信號(hào)。另一個(gè)保守區(qū)稱為－10區(qū)，即轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的10個(gè)核苷酸，提供DNA雙鏈解旋信號(hào)。

RNA聚合酶首先沿著DNA滑動(dòng)直至遇到－35區(qū)，形成一個(gè)起始的蛋白-DNA復(fù)合體（包括亞基），稱為封閉性復(fù)合體。這個(gè)復(fù)合體向3ˊ方向移動(dòng)到－10區(qū)，啟動(dòng)DNA雙鏈解旋，將模板上的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)暴露出來，此時(shí)RNA聚合酶和DNA形成的復(fù)合體稱為開放性復(fù)合體，它構(gòu)成了活性的轉(zhuǎn)錄單元。－10區(qū)是個(gè)富含A-T的區(qū)，由于A-T堿基對(duì)之間的氫鍵弱，所以容易使螺旋解旋。（a）轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子調(diào)控下起始來自噬菌體和細(xì)菌的10個(gè)基因的啟動(dòng)子序列來自噬菌體和細(xì)菌的10個(gè)基因的啟動(dòng)子序列，這些啟動(dòng)子都可被RNA聚合酶中的70亞基（E.coli中最常見的一種亞基）識(shí)別。

298個(gè)大腸桿菌啟動(dòng)子共有序列（b）鏈延伸是一個(gè)核苷酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)

RNA聚合酶催化鏈沿著5ˊ至3ˊ方向延伸。鏈延伸所需的下一個(gè)核苷三磷酸經(jīng)聚合酶驗(yàn)證與模板上相應(yīng)的未配對(duì)的核苷酸正確地形成氫鍵，然后RNA聚合酶催化延伸著的RNA鏈的3ˊ-羥基對(duì)新進(jìn)來的核苷三磷酸的α-磷進(jìn)行親核攻擊，這一核苷酸基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的結(jié)果是一個(gè)新的磷酸二酯鍵的形成和釋放出焦磷酸，焦磷酸水解為無機(jī)磷酸釋放能量保證了反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)開始延伸后，亞基立刻從RNA聚合酶上脫落。隨著RNA的延伸，已合成的RNA鏈離開模板，原來解旋的DNA又恢復(fù)雙螺旋。DNA雙鏈解旋時(shí)會(huì)使延伸泡前面產(chǎn)生扭曲應(yīng)力，拓?fù)洚悩?gòu)酶會(huì)防止扭曲應(yīng)力的凈增加。

RNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)轉(zhuǎn)錄延伸編碼鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄的RNA（c）轉(zhuǎn)錄終止在特殊的終止子序列

在大腸桿菌中存在著兩種終止機(jī)制，一種是蛋白依賴性的鏈終止，即一個(gè)終止蛋白與RNA聚合酶復(fù)合體相互作用恰好終止在一個(gè)發(fā)卡環(huán)處，發(fā)卡環(huán)是在新合成的轉(zhuǎn)錄鏈上形成的。蛋白是一個(gè)ATP依賴性的RNA-DNA解旋酶，其功能是破壞了RNA-DNA雜化體，導(dǎo)致延伸復(fù)合體的解離，使合成的RNA鏈釋放出來。

蛋白依賴性的鏈終止蛋白沿著mRNA移動(dòng)當(dāng)聚合酶停止在終止位置時(shí)，蛋白與酶結(jié)合蛋白與酶作用，新合成mRNA釋放終止位置RNA聚合酶蛋白另一種是蛋白非依賴性的終止作用，其特征是也有一個(gè)類似的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，發(fā)卡下游處的模板鏈上恰好存在一串腺苷酸，對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄鏈應(yīng)是一串尿苷酸。所以轉(zhuǎn)錄終止也許是當(dāng)延伸復(fù)合體停止在發(fā)卡結(jié)構(gòu)處時(shí)，使得A-U配對(duì)堿基的RNA-DNA雜化體不穩(wěn)定，導(dǎo)致復(fù)合體的解體而終止轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡環(huán)DNA中模板鏈反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄被轉(zhuǎn)錄的最后一個(gè)堿基蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄終止蛋白非依賴性的轉(zhuǎn)錄終止36.3一些抗生素是RNA合成的抑制劑

放線菌素D來自鏈霉菌，可以嵌入雙鏈DNA中。放線菌素D中的吩惡嗪酮環(huán)插入到相鄰的G-C堿基對(duì)之間，結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀多肽占據(jù)了DNA雙螺旋的空間，阻塞了轉(zhuǎn)錄的延伸。即使在很低的濃度下，放線菌素D都能有效地抑制原核生物和真核生物轉(zhuǎn)錄的延伸過程。利福霉素是另一個(gè)非常有用的抗生素，也是從鏈霉菌分離出來的。利福霉素通過直接與細(xì)菌中的RNA聚合酶的亞基結(jié)合來抑制RNA合成，特異地抑制第一個(gè)磷酸二酯鍵的形成。由于利福霉素不抑制真核生物的RNA聚合酶，所以一個(gè)合成的利福霉素衍生物利福平已用作為臨床的抗結(jié)核菌藥。

放線菌素D36.4初始RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都需經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工1、初始mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工初始mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物要經(jīng)過在其5ˊ端加一個(gè)甲基化的“帽子”和在3ˊ端加上一個(gè)多聚腺苷酸的尾巴，并且要切去內(nèi)含子，將外顯子拼接在一起構(gòu)成一個(gè)功能性的mRNA。

大多數(shù)真核生物中編碼蛋白質(zhì)的基因是由編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的外顯子和散布在外顯子中非編碼序列的內(nèi)含子構(gòu)成的，即外顯子被非編碼序列內(nèi)含子隔開，所以真核生物基因又稱之為斷裂基因。剛轉(zhuǎn)錄出的RNA產(chǎn)物，也稱為非均一RNA（hnRNA）必須通過一種稱之RNA剪接機(jī)制進(jìn)行加工。細(xì)菌基因的編碼序列是連續(xù)的，轉(zhuǎn)錄后的mRNA不需加工就可直接作為模板翻譯蛋白質(zhì)。通過成熟RNA-DNA雜交給出了雞卵清蛋白的非編碼序列（內(nèi)含子）灰色表示非編碼序列（內(nèi)含子）藍(lán)色表示編碼序列（外顯子）綠色表示成熟mRNA真核生物mRNA的5ˊ端有一個(gè)“帽子”結(jié)構(gòu)，是由稀有的7-甲基鳥嘌呤通過5ˊ,5ˊ－三磷酸鍵與初始轉(zhuǎn)錄物的起始（5ˊ）核苷酸連接形成的。這個(gè)帽子是在轉(zhuǎn)錄到20個(gè)核苷酸時(shí)在轉(zhuǎn)鳥嘌呤核苷酸酶催化下加到5ˊ端的。

mRNA上的5ˊ帽子對(duì)于蛋白質(zhì)合成的起始是很重要的，同時(shí)它可保護(hù)mRNA轉(zhuǎn)錄本不被核酸外切酶降解。

真核生物的mRNA的3ˊ端是通過涉及一個(gè)大的蛋白復(fù)合物的兩步反應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾的。在第一步反應(yīng)中，一個(gè)聚腺苷酸化作用斷裂特異因子（CPSF）識(shí)別并結(jié)合出現(xiàn)于大多數(shù)mRNA的3ˊ端的AAUAA序列。另一個(gè)稱為斷裂刺激因子（CSTF）的蛋白復(fù)合物與CPSF相互作用激活mRNA在AAUAA下游大約20個(gè)核苷酸的部位斷裂。在第二步3ˊ加工反應(yīng)中，聚腺苷酸聚合酶（PAP）結(jié)合于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的游離的3ˊ端，加上大約20個(gè)腺苷酸的3ˊ端的poly（A）尾巴，這個(gè)短的尾巴通過寡聚腺苷酸結(jié)合蛋白刺激PAP活性再進(jìn)一步延伸到大約200個(gè)腺苷酸。聚腺苷酸化反應(yīng)是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)步驟，因?yàn)榫巯佘账嵛舶偷拈L度能調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。真核生物mRNA3ˊ端的聚腺苷酸化hnRNA加工成mRNA的過程外顯子1外顯子2外顯子3內(nèi)含子5’末端加帽和轉(zhuǎn)錄終止3’末端剪切和聚腺苷酸化剪去內(nèi)含子并拼接向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)一些小核RNA和輔助蛋白形成核內(nèi)核糖核蛋白（snRNP）識(shí)別剪接位點(diǎn)和參與剪接。在第一次轉(zhuǎn)酯基反應(yīng)中，內(nèi)含子中的一個(gè)腺苷酸2ˊ羥基和同一內(nèi)含子中5ˊ核苷酸之間形成一個(gè)不常見的2ˊ,5ˊ-磷酸二酯鍵。在第二次轉(zhuǎn)酯基反應(yīng)中，上游外顯子的3ˊ羥基攻擊處于下游的外顯子－內(nèi)含子邊界的5ˊ磷酸。這一拼接反應(yīng)涉及稱之套索的一個(gè)中間體結(jié)構(gòu)的形成，它是第二次轉(zhuǎn)酯基反應(yīng)之后釋放出來的。套索中的2ˊ,5ˊ-磷酸二酯鍵位于稱之分支點(diǎn)的部位，這個(gè)部位形成了一個(gè)帶有3個(gè)磷酸二酯鍵的結(jié)構(gòu)，即腺苷酸殘基與內(nèi)含子的其余部分是通過標(biāo)準(zhǔn)的3ˊ,5ˊ-磷酸二酯鍵連接的。大多數(shù)初始mRNA剪接涉及到兩步轉(zhuǎn)酯基反應(yīng)

內(nèi)含子外顯子1外顯子2剪接點(diǎn)內(nèi)含子外顯子1外顯子2外顯子2外顯子13剪接部位5剪接部位2、初始

rRNA加工

大腸桿菌中在單一的轉(zhuǎn)錄本內(nèi)就含有7個(gè)rRNA基因的拷貝。初級(jí)轉(zhuǎn)錄物大約含有6500個(gè)核苷酸，編碼23S和16SrRNA，同時(shí)還編碼著幾種tRNA和小的5SrRNA。

分子克隆和核酸測(cè)序表明，23SrRNA大約含有2900核苷酸，而16SrRNA大約含有1600核苷酸。將初始轉(zhuǎn)錄物加工成23SrRNA和16SrRNA需要特異的核酸酶（RNases）催化。下圖給出了把人的45SrRNA加工成28S和18S兩個(gè)有功能的rRNA的加工過程的示意圖。

將人45SrRNA

加工成28S和18S兩個(gè)有功能的rRNA的過程

1.RNase通過tRNA剪接反應(yīng)除去內(nèi)含子。2.對(duì)某些tRNA通過核苷酸基轉(zhuǎn)移酶加上末端CCA序列。3.進(jìn)行特異堿基修飾。3、tRNA的加工反密碼子加氨基酸部位加工

1981年Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA內(nèi)含子的切除和外顯子的拼接不需要酶催化，而是一個(gè)RNA自我拼接的過程。具有催化功能的RNA分子稱為核酶。36.5核酶是個(gè)位置特異的核酸內(nèi)切酶剪接過程：1、外部的鳥苷與內(nèi)含子的5ˊ核苷酸形成新的磷酸二酯鍵，釋放出外顯子1的3ˊOH。2、出外顯子1的3ˊOH攻擊外顯子2的5ˊ磷酸，形成磷酸二酯健，將兩個(gè)外顯子連接在一起。3、內(nèi)含子去除5ˊ端片段后形成環(huán)狀。外顯子1外顯子2內(nèi)含子36.6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控－操縱子學(xué)說一個(gè)基因指的是編碼蛋白質(zhì)多肽鏈和功能RNA的DNA（某些病毒基因?yàn)镽NA），基因表達(dá)就是遺傳信息杜轉(zhuǎn)錄和翻譯過程?；虮磉_(dá)的調(diào)控可以在不同水平，例如轉(zhuǎn)錄水平，或翻譯水平上進(jìn)行。原核生物的基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行，因?yàn)樗麄兊霓D(zhuǎn)錄和翻譯過程可同時(shí)進(jìn)行。真核生物的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程在時(shí)間和空間上都被分隔開，而且轉(zhuǎn)錄和翻譯后都要經(jīng)過復(fù)雜的加工過程，所以其基因調(diào)控在不同水平都需要進(jìn)行調(diào)控。Jacob和Monod在對(duì)大腸桿菌乳糖發(fā)酵過程中酶的生物合成研究時(shí)，探討了基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，并提出了乳糖操縱子模型。操縱子：由一個(gè)啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)錄的幾個(gè)不同基因組成的轉(zhuǎn)錄單位，即由啟動(dòng)子序列、操縱基因和受操縱基因調(diào)控的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)基因（結(jié)構(gòu)基因）組成的基因表達(dá)單位。操縱子模型可以很好說明原核生物基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。調(diào)節(jié)物基因控制部位幾個(gè)相關(guān)基因（結(jié)構(gòu)基因）操縱子的一般結(jié)構(gòu)大腸桿菌乳糖操縱子

大腸桿菌乳糖操縱子包括依次排列的啟動(dòng)子、操縱基因和三個(gè)結(jié)構(gòu)基因。結(jié)構(gòu)基因Z編碼分解乳糖的-半乳糖苷酶、Y編碼吸收乳糖的-半乳糖苷透性酶、a編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。O代表操縱基因，i代表調(diào)節(jié)基因，P代表啟動(dòng)子。如果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是一條多順反子mRNA。

大腸桿菌能夠利用乳糖作為它的唯一碳源，但需要合成代謝乳糖的三個(gè)酶：-半乳糖苷酶（降解乳糖生成半乳糖和葡萄糖）、-半乳糖苷透性酶（使乳糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)）、-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶（半乳糖代謝時(shí)需要的酶）。這三個(gè)酶都是乳糖存在時(shí)誘導(dǎo)生成的酶。乳糖操縱子

當(dāng)細(xì)胞中沒有乳糖或其他誘導(dǎo)物時(shí)，調(diào)節(jié)物基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)生成阻遏物，然后阻遏物特異與操縱基因結(jié)合，阻止z、y、a基因的轉(zhuǎn)錄。阻遏物阻遏物與操縱基因結(jié)合，阻止z、y、a基因轉(zhuǎn)錄當(dāng)細(xì)胞中存在乳糖或其他誘導(dǎo)物時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏物結(jié)合，使阻遏物構(gòu)象發(fā)生變化，從而使阻遏物不能與操縱基因結(jié)合。這種狀況下，在RNA聚合酶催化下可以進(jìn)行z、y、a基因的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)物要點(diǎn)歸納

1.RNA合成需要DNA依賴性的RNA聚合酶全酶，E.coliRNA聚合酶全酶亞基組成為αβ2βˊσ，其中的σ亞基在轉(zhuǎn)錄起始時(shí)被用來識(shí)別啟動(dòng)子，該酶的核心酶亞基組成為αβ2βˊ。真核生物的細(xì)胞核中存在3種不同的RNA聚合酶：RNApolⅠ負(fù)責(zé)合成rRNA前體，而RNApolⅡ負(fù)責(zé)合成mRNA前體，RNApolⅢ負(fù)責(zé)合成tRNA前體。

2.RNA聚合酶催化以DNA模板鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)的、反平行的RNA，用的底物是核糖核苷三磷酸，不需要引物。RNA聚合酶催化3′羥基與核苷三磷酸的5′-α-磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵，使核苷酸整合到延伸的聚核苷酸鏈中，同時(shí)釋放出焦磷酸，焦磷酸水解釋放的能量驅(qū)動(dòng)聚合反應(yīng)。RNA合成方向是5′→3′方向。另外RNA聚合酶不具有校正核酸酶活性。

3.

轉(zhuǎn)錄包括3個(gè)階段：起始、延伸和終止。在原核生物中（如E.coli），當(dāng)σ亞基與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合形成全酶后附著在DNA的啟動(dòng)子區(qū)時(shí)，轉(zhuǎn)錄起始。然后通過自啟作用結(jié)合ATP（GTP），ATP（GTP）提供3′-羥基用于第二個(gè)核苷酸的聚合，即RNA合成不需要預(yù)先存在的引物。啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄開始合成新鏈后，σ亞基從全酶上解離。

4.當(dāng)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行時(shí)，DNA局部解旋，形成所謂的轉(zhuǎn)錄泡，轉(zhuǎn)錄泡以每秒50個(gè)核苷酸的速度沿著DNA模板移動(dòng)。新合成的RNA鏈含有結(jié)束轉(zhuǎn)