色譜基礎(chǔ)知識

PARTⅠ色譜基礎(chǔ)知識南方醫(yī)院臨床試驗研究中心李科聯(lián)系電話：62787825/62787815一、色譜起源色譜法起源于20世紀初，1906年俄國植物學(xué)家米哈伊茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實現(xiàn)分離，由一條色帶分散為數(shù)條平行的色帶。由于這一實驗將混合的植物色素分離為不同的色帶，因此茨維特將這種方法命名為色譜法。石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分色譜的主要目的是對混合物中的目標物分離和定量

色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進行分離的技術(shù)流動相：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動的一相，色譜柱色譜優(yōu)點同時分析分離性能好靈敏度高（ppm-ppb微克-納克）進樣量?。?-100μL）色譜分類以流動相狀態(tài)為標準劃分類型。用氣體作為流動相的色譜法稱為氣相色譜法GaschromatographyGC.用液體作為流動相的色譜法稱為液相色譜法LiquidchromatographyLC.HPLCVSGC液相色譜：適用于高沸點大分子強極性熱穩(wěn)定性差的化合物的分析，流動相具有運載樣品分子和選擇性分離的雙重作用氣相色譜：適用于沸點低，熱穩(wěn)定性好的中,小化合物的分析。流動相只起到運載樣品分子的作用HPLCVSGC高效液相色譜法采用高壓輸液泵輸送流動相及特殊規(guī)格填料固定相等，分離效能高，應(yīng)用范圍廣,如氨基酸蛋白質(zhì)生物堿維生素有機酸農(nóng)藥，都可用高效液相色譜法進行分析氣相色譜法雖然也具有快速分離效率高用樣少等優(yōu)點，但它要求樣品必須能夠汽化，從而受到樣品的揮發(fā)性限制。HPLC的分離類型正相色譜(NP-HPLC)反相色譜(RP-HPLC)反相離子對色譜(RPIC)離子交換色譜(IEC)空間排阻色譜(SEC)手性化合物分離模式(Chiralseparationmode)液相色譜按兩相極性不同分為:正相色譜反相色譜

化合物保留時間隨流動相配比的變化 不同極性的化合物出峰順序反相HPLC色譜柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty

反向色譜:反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。適用于能溶于水/有機混合物的中性或非離子化合物樣品

反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。

正相HPLC色譜柱硅膠型

氰基型

氨基型

糖類分析二醇基型蛋白質(zhì)分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi正相色譜：固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能基團，如（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。適用于不溶于水/有機混合物的親脂類樣品使用的流動相（極性相對比固定相低，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。液相色譜流程圖輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理色譜柱基本性能參數(shù)硅膠純度填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度尺寸填料床的長度和內(nèi)徑粒徑平均顆粒直徑，通常3-10μm孔徑顆粒的孔或者腔的平均尺寸，范圍80-100A封尾用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來色譜中常用的術(shù)語色譜圖組分從色譜柱流出并通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的微分曲線基線

正常情況下，僅有流動相通過檢測線時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線。峰高（h）峰最大值到峰底的距離峰寬（W）

峰兩側(cè)拐點處所做切線與峰底相交兩點間的距離。峰高一半處的峰寬叫半高峰寬（W?h）死時間（t0）實際上就是流動相流經(jīng)色譜柱所需要的時間保留時間（tR）從進樣開始到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點時為止所經(jīng)歷的時間,稱為此組分的保留時間

調(diào)整保留時間(t'R)扣除死時間后的保留時間

t'R=tR-t0

容量因子（k）k=t'R

／t0k值越大，組分出柱越慢，保留時間越長柱效柱效簡而言之就是色譜柱對色譜中物質(zhì)分離能力的大小。柱效越高，分離效果越好，峰形越好。色譜柱的柱效和填料、柱長、柱內(nèi)徑均有關(guān)系，一般來說，填料越細密、柱長徑比越大，柱效越高。柱校的衡量用理論塔板數(shù)來表示。

理論塔板數(shù)（n）n=5.54×(tR/W?h)2

n=16×(tR/W)2理論塔板高度（H）H=L/nL:色譜柱長分離度（R)R=2（tR2-tR1）/（W1+W2)相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰寬總和一半的比值。R<1時,兩峰有部分重疊R=1時,分離程度可達98%R=1.5時,分離程度達99.7%，可認為兩組分完全分離增加柱長可以提高分離度，但延長了分析時間拖尾因子（T）T=W0.05/2d0.05W0.05

W0.055%峰高處峰寬D0.055%峰高處的前半峰寬中國藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95～1.05。T<0.95為前延峰，T>1.05為拖尾峰。

色譜圖的峰位置用于定性，色譜峰的峰高和峰面積用于定量，峰位置和峰寬用于色譜柱分離性能的評價和色譜條件的優(yōu)劣。流動相流動相選擇注意事項：純度：采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配溶劑等級水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因為不純物的存在，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物吸光率HPLC用水可以通過以下幾個方面來得到：1專門的純水機或超純水機；2去離子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用類似家用的純水機；5市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水；6其它途徑；不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)越高放置時間越短。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。溶劑前處理

過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸,70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑。溶劑前處理

脫氣

目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個溶劑所能容納的空氣總量要小氣泡對測定的影響：

1）柱壓波動，流量偏小

2）基線波動

返回等度洗脫輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑梯度洗脫

A泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器B泵AB時間B

濃度分析時間長分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脫95%30%MeOH

濃度梯度洗脫混合器低壓梯度比例閥高壓梯度低壓梯度脫氣機高壓/低壓梯度系統(tǒng)返回高壓梯度系統(tǒng)梯度準確度好系統(tǒng)復(fù)雜(需兩臺或三臺泵)低壓梯度系統(tǒng)系統(tǒng)簡單需在線脫氣機存在時間滯后效應(yīng)高壓/低壓梯度系統(tǒng)泵的保養(yǎng)使用流動相盡量要清潔；進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相交換時要防止沉淀；

避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染；色譜柱1）柱壓低于150kgf/cm2（15cm色譜柱）2）柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃3）流動相PH使用范圍為2～7.5返回ODS柱的使用注意點：柱的保養(yǎng)：柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；進樣樣品要提純；嚴格控制進樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，