病原生物學(xué)試驗(yàn)課件NK活性測定

病原生物學(xué)試驗(yàn)課件NK活性測定NK細(xì)胞NK細(xì)胞屬于固有免疫細(xì)胞。NK殺傷靶細(xì)胞時(shí)既不需要特異性抗體參與，也不需要抗原預(yù)先致敏的淋巴細(xì)胞。在抗腫瘤和抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。MTT法檢測NK細(xì)胞活性原理：將NK細(xì)胞和靶細(xì)胞共同培養(yǎng)，NK細(xì)胞可殺傷靶細(xì)胞，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性黃色的MTT還原成藍(lán)紫色的Formazan結(jié)晶，并沉積在細(xì)胞里。而死細(xì)胞無此功能，通過比色檢測可以檢測培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)量，從而計(jì)算NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力。NK活性檢測效應(yīng)細(xì)胞：NK細(xì)胞（小鼠脾臟細(xì)胞）靶細(xì)胞：Yac-1細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)員準(zhǔn)備）2、靶細(xì)胞的制備（實(shí)驗(yàn)員準(zhǔn)備）：取對數(shù)生長期YAC-1細(xì)胞，Hanks液洗滌2次，計(jì)數(shù)，調(diào)整至2×105/ml。實(shí)驗(yàn)組靶細(xì)胞對照組效應(yīng)細(xì)胞對照組靶細(xì)胞100μl100μl－效應(yīng)細(xì)胞100μl－100μl1640培養(yǎng)基－100μl100μl3、細(xì)胞毒試驗(yàn)（96培養(yǎng)板）：每組做3個(gè)復(fù)孔NK細(xì)胞制備：小鼠脾細(xì)胞分離脫臼法處死小鼠，酒精棉球消毒皮膚，取脾，放入濾網(wǎng)，置于平皿中，在濾網(wǎng)脾臟處加入3mlHanks液;用試管底部碾磨脾臟，制成脾細(xì)胞懸液，200目濾網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液;離心（1500轉(zhuǎn)/分5min），棄去上清;加入Hanks液約3ml，重懸細(xì)胞，1500轉(zhuǎn)/分5min，去上清，加入約1ml1640培養(yǎng)液，混勻細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)：取細(xì)胞懸液10微升，加到含有390微升白細(xì)胞稀釋液的Eppendorf管中，混勻，取適量細(xì)胞懸液（約15ul），加入計(jì)數(shù)板中。在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，用1640完全培養(yǎng)基配成2×106/ml濃度的細(xì)胞懸液。

4、孵育

二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)；加10μl

MTT，繼續(xù)孵育2小時(shí)。5、測OD值

吸取上清約150ul，加150μl

二甲亞砜，振蕩10min，測OD值。（1-實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對照組OD值靶細(xì)胞對照組OD值）×100%NK細(xì)胞活性（%）=6、結(jié)果分析DBCA

A

BCD細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算公式一大格細(xì)胞數(shù)10440（稀釋倍數(shù)）舉例：10010440=4107稀釋：取0.1ml細(xì)胞原液，加入1.9ml培養(yǎng)液，即為2106/ml