實(shí)驗(yàn)六、植物基因組DNA提取

實(shí)驗(yàn)六植物基因組DNA提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、掌握提取DNA的方法，該方法提取的DNA可用作PCR模板、限制性酶切反應(yīng)和Southern印跡分析。

2、提取銀杏葉片總DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析檢測(cè)所提取DNA的純度和完整性。二、材料、試劑和儀器

材料：銀杏成熟葉片試劑：

（1）DNA提取液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0),2100mmol/LNaCl,50mmol/LEDTA,20g/LPVP,20g/LCTAB,140mmol/Lβ-ME(β-ME在使用前加)

（2）氯仿：異戊醇(24:1),無(wú)水乙醇,70%乙醇（3）瓊脂糖、50×TAE緩沖液等三、原理

利用液氮對(duì)植物組織進(jìn)行研磨，破碎細(xì)胞，提取液中的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶解膜蛋白，破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀。EDTA抑制DNA酶活性。再用氯仿抽提去除蛋白，得到的DNA用異丙醇或乙醇沉淀。一般生物體基因組DNA約107-8bp。制備基因組DNA的方法都要考慮兩個(gè)原則：〈1〉防止和抑制內(nèi)源DNase對(duì)DNA的降解；〈2〉盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。Note:

1）提取植物基因組DNA的常用方法：CTAB法、SDS法、尿素法等

2）CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（＞0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1~0.5mM）下因溶解度降低而沉淀，而此時(shí)大部分蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心沉淀后得到的CTAB-復(fù)合物用70%~75%的酒精浸泡可洗脫掉CTAB。氯仿/異戊醇（24：1）抽提可去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等，異戊醇或乙醇可用來(lái)沉淀DNA。

3）機(jī)械剪刀力包括：強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌、使核酸溶液快速通過(guò)狹長(zhǎng)孔道、反復(fù)凍融、長(zhǎng)時(shí)間煮沸等四、實(shí)驗(yàn)步驟1）取銀杏葉片2~3克，加入3mL提取液（65℃預(yù)熱60min）研磨，研磨后轉(zhuǎn)入10mL的離心管中；2）65℃水浴30min，其間溫和搖蕩離心管2-3次，水浴后取出室溫冷卻5min；3）加入等體積氯仿﹕異戊醇（24﹕1）（3mL左右），輕輕搖動(dòng)3min使其充分混勻，于5000rpm離心10min;4）取上清于新的10mL離心管中，加等體積氯仿﹕異戊醇（24﹕1）重復(fù)步驟3；5）取上清液于10mL離心管中，加2.5倍體積（約7.5mL）無(wú)水乙醇，輕輕搖動(dòng)，沉淀DNA；6）用牙簽或槍頭等輕輕挑取絮狀DNA沉淀，或者置于高速離心機(jī)中以12000rpm轉(zhuǎn)速離心10min,去上清；加70%乙醇洗滌2次（每次8min）,去70%乙醇，鼓風(fēng)或室溫下干燥DNA；7）加200~500μLTE溶解DNA，溶解后在4℃保存?zhèn)溆谩?）在0.8%的瓊脂糖凝膠（含0.1μg/ml溴化乙錠）上穩(wěn)壓電泳(電壓<5V/cm)檢測(cè)基因組DNA。作業(yè)1