微生物的生長及其控制

第六章微生物的生長及其控制通過本章的學(xué)習(xí)，要求掌握：1、微生物生長的研究方法；2、細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線各個(gè)時(shí)期的主要特點(diǎn)；3、物理因子，化學(xué)藥物對(duì)微生物生長的影響；4、微生物生長的控制。

重點(diǎn)：細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線，微生物生長的控制。

難點(diǎn)：如何利用細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線的對(duì)數(shù)生長期來計(jì)算細(xì)菌的代時(shí)和代數(shù)。第一節(jié)微生物生長的研究方法生長:微生物在適宜的環(huán)境條件下，不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并按照自己的代謝方式進(jìn)行代謝活動(dòng)，如果同化作用大于異化作用，則細(xì)胞質(zhì)的量不斷增加，體積得以加大，于是表現(xiàn)為生長。簡單地說，生長growth就是有機(jī)體的細(xì)胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加。繁殖:單細(xì)胞微生物如細(xì)菌，生長往往伴隨著細(xì)胞數(shù)目的增加。當(dāng)細(xì)胞增長到一定程度時(shí)，就以二分分裂方式形成兩個(gè)基本相同的子細(xì)胞。這種由于細(xì)胞分裂而引起的個(gè)體數(shù)目的增加，稱為繁殖reproduction。在多細(xì)胞微生物中，如某些霉菌，細(xì)胞數(shù)目的增加（菌絲細(xì)胞的不斷延長或分裂）如不伴隨著個(gè)體數(shù)目的增加，只能叫生長。只有通過形成無性孢子或有性孢子使得個(gè)體數(shù)目增加的過程才叫做繁殖。發(fā)育:在一般情況下，當(dāng)環(huán)境條件適合，生長與繁殖始終是交替進(jìn)行的。從生長到繁殖是一個(gè)由量變到質(zhì)變的過程，這個(gè)過程就是發(fā)育development。如果某一或某些環(huán)境條件發(fā)生改變，并超出了生物可以適應(yīng)的范圍時(shí)，就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生抑制乃至殺滅作用。一、純培養(yǎng)技術(shù)

微生物在自然界總是混雜地生活在一起，要想研究某一種微生物，必須把研究對(duì)象從混雜群體中分離出來。微生物學(xué)中將在實(shí)驗(yàn)室條件下由一個(gè)細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖的后代稱為純培養(yǎng)pureculture。獲得純培養(yǎng)的方法:1、稀釋倒平板法2、稀釋涂布法3、劃線分離法streakplatemethod平行劃線連續(xù)劃線此法主要用于雜菌不多的標(biāo)本。分區(qū)劃線本法適用于雜菌量較多的標(biāo)本。獲得單個(gè)菌落。4、顯微操作儀直接挑取單個(gè)細(xì)胞（適于原生動(dòng)物、單細(xì)胞藻類等）5、稀釋搖管法（分離厭氧菌）6、液體培養(yǎng)基稀釋分離7、選擇性培養(yǎng)基分離根據(jù)所要分離的菌種的特性選用培養(yǎng)基，如：①分離真菌用馬丁氏培養(yǎng)基，pH偏酸；分離放線菌用高氏1號(hào)培養(yǎng)基，pH中性偏堿。②不同微生物對(duì)化學(xué)試劑的敏感性不同：從土壤中分離細(xì)菌在培養(yǎng)基中加制霉菌素抑制真菌生長；從土壤中分離真菌時(shí)，在培養(yǎng)基中加孟加拉紅和鏈霉素抑制細(xì)菌生長。③根據(jù)分離對(duì)象的營養(yǎng)特征分離特殊微生物：分離纖維素分解菌時(shí)，培養(yǎng)基以纖維素為唯一碳源。分離固氮菌，用無氮培養(yǎng)基，以N2作氮源。二、微生物生長量的測定

1．測定總菌數(shù)（即總的細(xì)胞數(shù)量）：⑴計(jì)數(shù)板直接測數(shù)⑵染色涂片計(jì)數(shù)法⑶比濁法2.測定活菌數(shù)：（1）稀釋平板測數(shù)法（2）稀釋培養(yǎng)測數(shù)法（3）薄膜過濾計(jì)數(shù)法3.測定細(xì)胞生物量：（1）測定細(xì)胞干重（2）測定總氮量（3）測定DNA含量(4)測定ATP含量(5）測定代謝活性顯微計(jì)數(shù)法

染色涂片計(jì)數(shù)法

取0.01ml的菌懸液放在1cm2的玻片上，讓其干燥，然后固定染色，再置顯微鏡下計(jì)數(shù)每一視野中的菌數(shù)，算出視野面積，按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌數(shù)。

每ml菌液中的含菌數(shù)=視野中的平均菌數(shù)×1cm2/視野面積×100

比濁法

比濁法的原理是利用細(xì)菌細(xì)胞在溶液中數(shù)量越多，濁度越大，在光電比色計(jì)中測定時(shí)所吸收的光線越多（即透過的光線少）

方法是先要測定出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，即將菌液制成不同濁度的稀釋液，將此不同濁度的稀釋液用光電比色計(jì)測出其消光值，再把這各種濁度的稀釋液用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法測出其中的含菌數(shù)，以不同濁度的稀釋液的消光值作縱坐標(biāo)，以不同濁度稀釋液所含的菌數(shù)作橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。有了標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以取未知菌液測消光值后通過查此曲線得知未知菌液中的含菌數(shù)。此方法在工業(yè)發(fā)酵中應(yīng)用較多，因?yàn)樗焖?，?jié)約時(shí)間。測定微生物的活菌數(shù)viablecount

稀釋平板測數(shù)法diluteplatecount以CFU(colonyformingunits)表示

稀釋培養(yǎng)測數(shù)法（又稱最大概率法，MPNmostprobablenumber）

例如：某細(xì)菌在稀釋培養(yǎng)法中生長情況如下：稀釋度:10—310—410—510—610—710—8重復(fù)數(shù):555555有菌生長管數(shù)：555410根據(jù)上述結(jié)果，數(shù)量指標(biāo)為“541”，查表得近似值為17，乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)，得出原始培養(yǎng)物的活菌數(shù)=17×105個(gè)

薄膜過濾計(jì)數(shù)法；

此法用于計(jì)數(shù)空氣中的含菌數(shù)當(dāng)一定體積的空氣通過濾膜后，將濾膜培養(yǎng)后計(jì)數(shù)濾膜上的菌落數(shù)即可求出單位體積空氣中的含菌數(shù)。細(xì)胞生物量測定1.細(xì)胞干重測定：單位體積的培養(yǎng)液中的微生物細(xì)胞的干重。（如菌絲干重g/100ml）2.總氮量測定法：用化學(xué)分析方法測出微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)或氮元素的含量。

蛋白質(zhì)的含量=氮量×6.253.DNA含量測定法：用熒光法測定微生物細(xì)胞中DNA含量。細(xì)菌平均每個(gè)含DNA的量為8.4×10—5ng，若測得某樣品中的DNA含量為8.4×10-2ng，則測定樣品中含有1000個(gè)細(xì)菌

4.ATP含量測定法:以分光光度法測定它的熒光素—熒光素酶反應(yīng)的強(qiáng)度,經(jīng)換算即可求得生物量。5.代謝活性法：根據(jù)微生物生命活動(dòng)的強(qiáng)度來估算生物量。如單位體積培養(yǎng)物在單位時(shí)間內(nèi)的O2消耗、糖消耗或產(chǎn)酸產(chǎn)CO2量等，它們?cè)谝欢ǔ潭壬祥g接地反映細(xì)胞生物量。三、同步培養(yǎng)在分批培養(yǎng)中，各個(gè)細(xì)胞的生理狀態(tài)、代謝活動(dòng)并不完全一樣。如果以群體測定結(jié)果的平均值來代表單個(gè)細(xì)胞的生長或生理特性是不符合客觀實(shí)際的，然而利用單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行研究又是很困難的。為了解決這一問題，就必須設(shè)法使群體處于同一發(fā)育階段，使群體和個(gè)體行為變得一致，因而發(fā)展了單細(xì)胞的同步培養(yǎng)技術(shù)。同步培養(yǎng)法：能使培養(yǎng)的微生物處于比較一致的生長發(fā)育階段上的培養(yǎng)方法叫同步培養(yǎng)法synchronousculture。

過濾分離法1、機(jī)械法區(qū)帶離心法膜洗脫法

溫度調(diào)整法2、誘導(dǎo)法營養(yǎng)調(diào)整法芽孢萌發(fā)法

3、解除抑制法：采用碟呤等代謝抑制劑阻斷細(xì)胞DNA的合成，然后大量稀釋解除抑制，使細(xì)胞同步生長。

機(jī)械法對(duì)細(xì)胞正常生理代謝影響很少；而誘導(dǎo)同步分裂雖然方法多，應(yīng)用較廣，但對(duì)正常代謝有時(shí)有影響，而且對(duì)其誘導(dǎo)同步化的生化基礎(chǔ)了解很少，化學(xué)誘導(dǎo)同步化的本質(zhì)還是一個(gè)尚待研究的問題。同步生長的時(shí)間，因菌種和條件而變化，由于同步群體的個(gè)體差異，同步生長不能無限地維持，往往會(huì)逐漸破壞，最多能維持2~3個(gè)世代，又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長，即非同步化。第二節(jié)、微生物的生長規(guī)律

以少量純培養(yǎng)細(xì)菌接種一定容積的培養(yǎng)基中經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲，此稱分批培養(yǎng)(batchculture)。利用分批培養(yǎng)可以測定細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線。一、細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線:將少量細(xì)菌的純培養(yǎng)體接種到新鮮的液體培養(yǎng)基中，定期測定菌體數(shù)量，開始時(shí)生長緩慢，然后細(xì)菌數(shù)目以對(duì)數(shù)增加，繼而穩(wěn)定在最高生長量上，最后逐漸降低，進(jìn)入衰老死亡階段，如用座標(biāo)法作圖，以時(shí)間為橫座標(biāo)，以菌數(shù)的對(duì)數(shù)增長量為縱座標(biāo)，可以繪出一條曲線，我們將此曲線叫做細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線。細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線衰亡期穩(wěn)定期對(duì)數(shù)期滯留期細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線的分期及各期特點(diǎn):①延滯期lagphase（滯留適應(yīng)期）菌種初接入新鮮培養(yǎng)液內(nèi)，微生物細(xì)胞需要通過自身生理機(jī)能的調(diào)節(jié)逐步適應(yīng)新環(huán)境。表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量不增加但細(xì)胞個(gè)體體積增大，代謝活躍。②對(duì)數(shù)期logarithmicgrowthphase細(xì)菌在這個(gè)時(shí)期生長旺盛，代謝活力強(qiáng)。分裂速度快，菌數(shù)以指數(shù)級(jí)數(shù)增加，代時(shí)穩(wěn)定。細(xì)胞在形態(tài)、生理等方面較為一致，是研究微生物生理代謝和遺傳變異的好材料。在工業(yè)生產(chǎn)中，也用對(duì)數(shù)期細(xì)胞作為擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液。利用對(duì)數(shù)生長期測定細(xì)菌的代時(shí)和代數(shù):

在對(duì)數(shù)生長期內(nèi)，細(xì)菌數(shù)目的增加是按指數(shù)級(jí)數(shù)增加的即20→21→22→23……2n

這里的指數(shù)n為細(xì)菌分裂的次數(shù)或者增殖的代數(shù)，也就是一個(gè)細(xì)菌繁殖n代產(chǎn)生2n

個(gè)細(xì)菌。如果在對(duì)數(shù)期開始時(shí)間t1的菌數(shù)為x1，繁殖n代后到對(duì)數(shù)期后期t2的菌數(shù)為x2，則代時(shí)（Generationtime，G）（即每增加一代所需要的時(shí)間）應(yīng)為：G=（t2-t1）/n先求代數(shù)n由于x2=x1·2nlgx2=lgx1+nlg2；n=（lgx2-lgx1）/lg2n=3.3·lg(x2/x1)即G=（t2-t1）/3.3·lg(x2/x1)

例如：在一細(xì)菌培養(yǎng)液中第一次測得的細(xì)菌數(shù)為104/ml，經(jīng)過培養(yǎng)4h后，又測得菌液中的細(xì)菌數(shù)為108/ml，求此菌的世代時(shí)間和在此時(shí)間內(nèi)繁殖的代數(shù)。根據(jù)公式：G=（t2-t1）/3.3·lg(x2/x1)t2-t1=（4-0）×60min=240min

x2=108

x1=104

lg(x2/x1)=lg108~lg104=8-4=4代入上式G=240/3.3×4=240/13.2=18min即在上述培養(yǎng)液中，世代時(shí)間為18min。細(xì)菌繁殖代數(shù)n=(t2-t1)/G=240/18=13.3代。③穩(wěn)定期(stationaryphase)又稱恒定期或最高生長期。處于穩(wěn)定期的微生物，新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，整個(gè)培養(yǎng)物中二者處于動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)生長速度，又逐漸趨向零。

在一定容積的培養(yǎng)基中，細(xì)菌為什么不能按對(duì)數(shù)期的高速率無限生長呢?這是由于對(duì)數(shù)期細(xì)菌活躍生長引起周圍環(huán)境條件條件發(fā)生了一系列變化，某些營養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害代謝產(chǎn)物的積累，以及諸如pH、氧化還原電位、溫度等的改變，限制了菌體細(xì)胞繼續(xù)以高速度進(jìn)行生長和分裂。

穩(wěn)定期的細(xì)胞內(nèi)開始積累貯藏物，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數(shù)芽孢細(xì)菌也在此階段形成芽孢。如果為了獲得大量菌體，就應(yīng)在此階段收獲，因這時(shí)細(xì)胞總數(shù)量最高；這一時(shí)期也是發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的重要階段，某些放線菌抗生素的大量形成也在此時(shí)期。從上可以看出，穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上的達(dá)到了最高水平，產(chǎn)物的積累也達(dá)到了高峰，此時(shí)，菌體的總產(chǎn)量與所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)之間存在著一定關(guān)系，這種關(guān)系，生產(chǎn)上稱為產(chǎn)量常數(shù)。④衰亡期(declinephase)細(xì)菌死亡率逐漸增加，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了“負(fù)生長”。其中有一段時(shí)間，活菌數(shù)換幾何級(jí)數(shù)下降，故有人稱之為“對(duì)數(shù)死亡階段”。這一階段的細(xì)胞，有的開始自溶，產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等。菌體細(xì)胞也呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時(shí)產(chǎn)生畸形，細(xì)胞大小懸殊，有的細(xì)胞內(nèi)多液泡，革蘭氏染色反應(yīng)的陽性菌變成陰性反應(yīng)等。

二、二次生長：當(dāng)培養(yǎng)液中同時(shí)存在兩種均能被微生物利用的主要營養(yǎng)物時(shí)，微生物將首先利用其中較易利用的營養(yǎng)物開始生長。當(dāng)較易利用的營養(yǎng)物被消耗完，進(jìn)入穩(wěn)定期后，微生物經(jīng)過短暫的適應(yīng)，開始利用第二種營養(yǎng)物，再次開始新的對(duì)數(shù)生長，并進(jìn)入新的穩(wěn)定期，表現(xiàn)為二階式的雙峰生長曲線，稱為二次生長曲線。三、連續(xù)生長（連續(xù)培養(yǎng)）當(dāng)微生物在一個(gè)固定的容器中生長時(shí)，由于養(yǎng)料的消耗，代謝產(chǎn)物的積累，必然會(huì)導(dǎo)致微生物生長速度減慢，為了保持微生物能長時(shí)期的處于對(duì)數(shù)生長期，就要采用連續(xù)培養(yǎng)continuousculture，即在一個(gè)恒定容積的流動(dòng)系統(tǒng)中，一方面以一定的速度不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速度流出培養(yǎng)物，這樣就可以使容器中微生物的數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持恒定，使微生物長期處于旺盛生長階段。

連續(xù)培養(yǎng)的原理是利用細(xì)菌在生長曲線中的對(duì)數(shù)期生長最快。恒化連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒濁連續(xù)培養(yǎng)：

不斷調(diào)節(jié)流速而使細(xì)菌培養(yǎng)物濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)叫恒濁連續(xù)培養(yǎng)。由光電裝置檢測培養(yǎng)容器中的濁度，根據(jù)濁度變化控制新鮮培養(yǎng)液流入和舊培養(yǎng)流出速度，使容器內(nèi)菌液濃度恒定。工業(yè)發(fā)酵中用此法可獲得大量菌體及代謝產(chǎn)物。恒化連續(xù)培養(yǎng)：

控制恒定流速，使由于細(xì)菌生長而耗去的營養(yǎng)物及時(shí)得到補(bǔ)充，又叫恒組成連續(xù)培養(yǎng)。這樣，細(xì)菌的生長速率將取決于限制性因子的濃度。恒化連續(xù)培養(yǎng)多用于微生物學(xué)的研究工作中。從遺傳學(xué)角度來講，它允許我們作長時(shí)間的細(xì)菌培養(yǎng)而能從中分離不出的變種；從生理學(xué)方面看，能幫助我們觀察細(xì)菌在不同生活條件下的變化，尤其是DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成的變化；同時(shí)它也是研究自然條件下微生物生態(tài)體系比較理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停驗(yàn)?，生長在自然界的微生物一般都處于低營養(yǎng)濃度條件下，生長也較慢。而恒定連續(xù)培養(yǎng)正好可通過調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)來維持培養(yǎng)基成分的低營養(yǎng)養(yǎng)濃度，使之與自然條件相類似。四、真菌的生長1、絲狀真菌在固體培養(yǎng)基上的生長繁殖

絲狀真菌菌絲生長與營養(yǎng)有關(guān)。營養(yǎng)豐富，分支多而密，營養(yǎng)貧乏，分支少而稀。菌絲的生長是頂端生長，菌絲各個(gè)部分都有極性之分，即位于前端的為幼齡菌絲，位于后面的為老齡菌絲。菌絲生長與營養(yǎng)有關(guān)，營養(yǎng)豐富則分支點(diǎn)與菌絲生長頂端的距離短，即分支多而頻繁；營養(yǎng)貧乏分支點(diǎn)同菌絲生長頂端距離長，即分支少。菌絲在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)形成菌落。2、絲狀真菌在液體培養(yǎng)基中的生長

絲狀真菌在液體培養(yǎng)基中的生長可分為三個(gè)生長階段即:延緩期迅速生長期衰退期3、孢子生長

真菌無性孢子的形成可分為五個(gè)階段：1、分生孢子梗形成2、核移動(dòng)到分生孢子梗內(nèi)3、分生孢子梗膨脹4、頂端出芽，并形成一串互相連通的芽5、芽與芽之間產(chǎn)生橫隔，將它們分隔成成串孢子無性孢子繁殖過程：孢子腫脹（外源腫脹，不需營養(yǎng)；內(nèi)源腫脹，需要營養(yǎng)）萌發(fā)管形成菌絲生長包括真菌有性孢子形成是由于性激素產(chǎn)生，研究較多的幾種性激素是：

1、三孢酸2、誘雄激素3、成精激素和成卵激素

綿霉的有性孢子形成過程分為以下幾個(gè)步驟1、首先由雌性菌體分泌一種類固醇性質(zhì)的成精激素（antheridiol），它可以連續(xù)不斷地產(chǎn)生，并擴(kuò)散到基質(zhì)中；2、雄性菌體在接受成精激素后，會(huì)發(fā)生多方面反應(yīng)，促進(jìn)其本身產(chǎn)生雄器或精子，同時(shí)，它可以反過來合成另一種激素稱為成卵激素（oogoniolhormone）；3、雌性菌體在接受成卵激素以前，沒有任何形態(tài)變化，直到接受了成卵激素后，才促進(jìn)形成藏卵器，并大量產(chǎn)生成精激素，以吸引雄器或精子；4、吸引和識(shí)別的結(jié)果使藏卵器與雄器結(jié)合，進(jìn)行有性生殖。4、真菌的二型現(xiàn)象有些真菌，尤其是絲狀真菌如毛霉和假絲酵母，在不同環(huán)境下，可以從菌絲型變?yōu)閱渭?xì)胞出芽酵母型，或者相反，由酵母型轉(zhuǎn)變?yōu)榫z型，這種生長型的轉(zhuǎn)變稱為二形現(xiàn)象。二型轉(zhuǎn)變受環(huán)境因子的控制。第三節(jié)影響微生物生長的主要因素生長是微生物與外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。環(huán)境條件的改變，在一定限度內(nèi)，可能引起：

A.微生物形態(tài)，生理、生長、繁殖等特征的改變，

B.微生物抵抗、適應(yīng)了環(huán)境條件的某些改變；

C.導(dǎo)致微生物的死亡。一、溫度對(duì)微生物生長的影響微生物生長的溫度類型低溫型微生物psychrophiles

又稱嗜冷微生物，可分為專性嗜冷和兼性嗜冷兩種。它們或者分布在地球兩極地區(qū)的水域和土壤中，這里大部分地區(qū)幾乎終年冰凍，即使在其微小的液態(tài)水間隙中也有微生物的存在；它們或者分布在平均溫度為5℃左右的海洋中;或者分布在只有1~2℃的海洋深處；還有的分布于冷泉。冷藏食物的腐敗往往由這類微生物引起。嗜冷微生物嗜冷機(jī)理：

1、細(xì)胞內(nèi)的酶在低溫下酶活性高；

2、細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量較高，細(xì)胞膜在低溫下仍保持半流動(dòng)狀態(tài)，從而能進(jìn)行活躍的物質(zhì)代謝。中溫型微生物mesophiles

它們又可分為室溫性微生物和體溫性微生物。室溫性微生物適于20~30℃生長，如土壤微生物、植物病原微生物。體溫性微生物多為人及溫血?jiǎng)游锏牟≡?，它們生長的極限范圍在10~45℃，最適生長溫度與其宿主體溫相近，在25~40℃之間，人體寄生菌為37℃左右。中溫型微生物不能在低溫條件下生長是由于：

1、中溫型微生物在低溫下蛋白質(zhì)的合成過程不能啟動(dòng)；

2、低溫下，受代謝產(chǎn)物的反饋抑制。高溫型微生物themophiles

它們適于在45~50℃以上的溫度中生長，在自然界中的分布僅局限制于某些地區(qū)，比如堆肥在發(fā)酵過程中溫度常高達(dá)60~70℃。能在55~70℃中生長的微生物有Bacillus、Methanobacterium等。分布于溫泉中的細(xì)菌，有的可在近于100℃的高溫中生長。這些耐高溫的微生物，經(jīng)常給罐頭工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)帶來麻煩。微生物的耐熱性一般而言：原核生物大于真核生物非光合微生物大于光合微生物簡單生物大于復(fù)雜生物高溫微生物耐高溫的主要原因：

1、具耐熱的酶和蛋白質(zhì)及其合成系統(tǒng)

2、細(xì)胞膜富含飽和脂肪酸，利于膜在高溫下保持穩(wěn)定

二、pH值對(duì)微生物生長的影響

微生物在pH4~9之間都可以生長。細(xì)菌最適pH為7.0~8.0

放線菌最適pH7.5~8.5

霉菌、酵母最適pH4.0~6.0

藻類6.0～7.0原生動(dòng)物6.0～8.0pH值影響微生物生長的主要作用在于：①引起細(xì)胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；②影響代謝過程中酶的活性；③改變營養(yǎng)物質(zhì)的可給性以及有害物質(zhì)的毒性。微生物生長繁殖的最適pH與其合成某種代謝產(chǎn)物的pH通常是不一樣的。例如丙酮丁醇梭菌生長繁殖最適pH是5.5~7.0，丙酮丁醇梭菌合成丙酮丁醇的最適pH是4.3~5.3。微生物在不同的pH下積累的代謝產(chǎn)物不一樣。黑曲霉在pH2~3的環(huán)境中發(fā)酵蔗糖以產(chǎn)檸檬酸為主，產(chǎn)草酸極少；而在pH近中性時(shí)發(fā)酵蔗糖產(chǎn)生大量的草酸，檸檬酸產(chǎn)量很低。可利用微生物對(duì)pH要求的不同，控制雜菌的污染。無機(jī)酸如硫酸、鹽酸等殺菌力雖強(qiáng)，但腐蝕性大,很少應(yīng)用；某些有機(jī)酸如苯甲酸可用作防腐劑；酸菜、飼料青貯則是利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸抑制腐敗性微生物的生長。強(qiáng)堿可用作殺菌劑，但由于其毒性大，用途有局限性。如生石灰用于對(duì)排泄物及倉庫、棚舍等環(huán)境的消毒。強(qiáng)堿對(duì)G+與病毒比對(duì)G-作用強(qiáng)。結(jié)核分枝桿菌抗堿力特強(qiáng)。三、氧與氧化還原電位根據(jù)氧與微生物生長的關(guān)系，可將微生物分成五類：①專性好氧微生物Strictaerobes

②專性厭氧微生物Strictanaerobes

③兼性厭氧微生物facultativeaerobes

④微好氧微生物microaerophilicbacteria⑤耐氧微生物aerotolerantanaerobes五類微生物的比較

微生物超氧化物歧化酶過氧化氫酶過氧化物酶專性好氧微生物++-專性厭氧微生物---兼性厭氧微生物++-微好氧微生物++-耐氧微生物+-+氧化還原電位（Eh值）與微生物生長的關(guān)系影響Eh的因素很多，分子態(tài)氧的影響尤為重要。其次是培養(yǎng)基中氧化還原物質(zhì)的影響。不同的微生物對(duì)氧化還原電位的要求不一樣。

好氣微生物要求Eh值在+0.1伏以上，以0.3至0.4伏為宜。兼性好氧微生物Eh值在0.1伏以上行呼吸作用，在0.1伏以下行發(fā)酵作用。厭氣性微生物Eh

值在0.1伏以下為宜。

向培養(yǎng)基中通入空氣或加入氧化劑可提高基質(zhì)中的Eh

值，以培養(yǎng)好氣微生物。在培養(yǎng)基中加入還原性物質(zhì)如半胱氨酸、亞硫酸鈉、Na2S等可降低基質(zhì)中的氧化還原電位，以培養(yǎng)厭氣性微生物。

第四節(jié)微生物的培養(yǎng)方法一、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法1、固體培養(yǎng)法①好氧菌的固體培養(yǎng)主要用試管斜面、培養(yǎng)皿瓊脂平板及較大型的克氏扁瓶、茄子瓶等進(jìn)行培養(yǎng)。②厭氧菌的固體培養(yǎng)A、高層瓊脂柱B、厭氧培養(yǎng)皿C、亨蓋特滾管技術(shù)D、厭氧罐E、厭氧手套箱2、液體培養(yǎng)法①好氧菌的液體培養(yǎng)A、試管培養(yǎng)B、三角瓶淺層液體培養(yǎng)C、搖瓶培養(yǎng)D、臺(tái)式發(fā)酵罐②厭氧菌的液體培養(yǎng)加巰基乙酸、半胱氨酸、維生素C等降低氧化還原電位，以適合厭氧菌的生長。二、生產(chǎn)實(shí)踐中培養(yǎng)微生物的裝置1、固態(tài)培養(yǎng)法①好氧菌的曲法培養(yǎng)②厭氧菌的堆積培養(yǎng)法2、液體培養(yǎng)法①好氧菌的培養(yǎng)A、淺盤培養(yǎng)B、深層液體通氣培養(yǎng)三、發(fā)酵罐（1）斜面培養(yǎng)：用于微生物形態(tài)觀察或菌種保藏。（2）培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)：用于分離和活菌計(jì)數(shù)。為了獲得較多菌體提高培養(yǎng)效率，采用增大培養(yǎng)表面積的辦法，實(shí)驗(yàn)室采用克氏瓶（茄子瓶）、羅氏瓶、錐形瓶。工廠采用曲盤、簾子以及通風(fēng)制曲池等方法培養(yǎng)菌體。

厭氧菌在有氧的情況下不能生長。要培養(yǎng)厭氧菌，必須創(chuàng)造一個(gè)無氧的環(huán)境。通常用培養(yǎng)基中加入還原劑，或用物理、化學(xué)方法去除環(huán)境中的游離氧，以降低氧化還原電勢。如皰肉培養(yǎng)基、硫基乙酸鈉培養(yǎng)基，牛心腦浸液培養(yǎng)基等。常用的厭氧培養(yǎng)方法有許多，可根據(jù)實(shí)際情況選用。

1．厭氧缸法

接種好標(biāo)本的平板或液體培養(yǎng)基試管，可放入?yún)捬醺變?nèi)培養(yǎng)，厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培養(yǎng)出來。

2．厭氧袋（Bio-bag）即在塑料袋內(nèi)造成厭氧環(huán)境來培養(yǎng)厭氧菌。塑料袋透明而不透氣，內(nèi)裝氣體發(fā)生管（有硼氫化鈉的碳酸氫鈉固體以及5%檸檬酸安瓿）、美蘭指示劑管、鈀催化劑管、干燥劑。放入已接種好的平板后，盡量擠出袋內(nèi)空氣，然后密封袋口。先折斷氣體發(fā)生管，后折斷美蘭指示劑管，命名袋內(nèi)在半小時(shí)內(nèi)造成無氣環(huán)境。如不突變表示袋內(nèi)已達(dá)厭氧狀態(tài)，可以孵育。

3．厭氧手套箱（Anaerobieglovebox）是迄今為止國際上公認(rèn)的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之一。它是一個(gè)密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個(gè)有機(jī)玻璃做的透明面板，板上裝有兩個(gè)手套，可通過手套在箱內(nèi)進(jìn)行操作，故名。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。欲放物入箱，先打開外門，放入交換室，關(guān)上外門進(jìn)行抽氣和換氣（H2，CO2，N2）達(dá)到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門打開，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門。箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，也是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中錢殘余氧化合成水的原理。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或孵箱即附在其內(nèi)，還可放入解剖顯微鏡便于觀察厭氧菌菌落，這種厭氧箱適于作厭氧細(xì)菌的大量培養(yǎng)研究，大量培養(yǎng)基可放入作預(yù)還原和厭氧性無菌試驗(yàn)。金屬硬壁型厭氧箱的抽氣、充氣、厭氧環(huán)境和溫度等均系自動(dòng)調(diào)節(jié)。

4.厭氧盒：原理同厭氧袋，有成品銷售。

5.生物耗氧法：在一密閉的容器內(nèi)放以生物（多是植物），消耗氧氣，同時(shí)產(chǎn)生二氧化碳，供細(xì)菌生長用。我沒見過。

6.焦性末食子酸法：在一潔凈的玻片上鋪上紗布或?yàn)V紙，均勻撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速將已接種細(xì)菌的平板倒扣在上面，用融化的白蠟封邊，造成一個(gè)封閉空間。焦性末食子酸與堿反應(yīng)后耗氧。該法用于厭氧不嚴(yán)格的厭氧菌的培養(yǎng)，簡單。如有梭狀芽孢桿菌。

7.皰肉培養(yǎng)基：本身就是一個(gè)不需特殊設(shè)備的厭氧培養(yǎng)法。皰肉和肉湯裝入大試管，液面封凡士林，造成無氧環(huán)境。

液體培養(yǎng)法

將微生物接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法叫液體培養(yǎng)法。該類方法有：

1．靜止培養(yǎng)

是指接種后的液體靜止不動(dòng)。由于所用容器不同，培養(yǎng)法也不同。試管培養(yǎng)法將菌接種到裝有10ml液體培養(yǎng)基的試管后搖勻，放入試管架上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)觀察微生物液體培養(yǎng)特征；淺盤培養(yǎng)法，將菌接入裝有液體培養(yǎng)基的搪瓷盤內(nèi)，使液面與空氣廣泛接觸。早年檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉時(shí)曾用此法。

2．搖瓶振蕩培養(yǎng)

由于其簡便、實(shí)用，自本世紀(jì)30年代問世以來，很快發(fā)展成為微生物培養(yǎng)中極重要的技術(shù)，廣泛用于種子培養(yǎng)、擴(kuò)大發(fā)酵用。搖瓶培養(yǎng)設(shè)備主要有旋轉(zhuǎn)式搖床和往復(fù)式搖床兩種類型（一般搖床須放入恒溫室，現(xiàn)已用自動(dòng)控溫的臺(tái)式搖床）。用旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行微生物振蕩培養(yǎng)時(shí)，固定在搖床上的錐形瓶隨搖床以200～250r／min的速度運(yùn)動(dòng)，由此帶動(dòng)培養(yǎng)物圍繞著錐形瓶內(nèi)壁平穩(wěn)轉(zhuǎn)動(dòng)。在用往復(fù)式搖床進(jìn)行振蕩培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)物被前后拋擲，引起較為激烈的攪拌和撞擊。如要獲得更大的氧供應(yīng)，可在較大的燒瓶（250～500ml錐形瓶）中裝相對(duì)較小容積的培養(yǎng)基（20～30ml）。由此可獲得更高的氧傳遞速率，便于細(xì)胞的迅速生長。若要獲得較低的氧供應(yīng)，則采用較慢的振蕩速度和相對(duì)大的培養(yǎng)體積。

3．發(fā)酵罐培養(yǎng)一般實(shí)驗(yàn)室中較大量的通氣擴(kuò)大培養(yǎng)，可采用小型發(fā)酵罐，罐容在5～30L，它可以供給所培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，使微生物均勻生長，大量生產(chǎn)微生物細(xì)胞或代謝產(chǎn)物，并可在實(shí)驗(yàn)過程中得到必要的數(shù)幾個(gè)基本概念

防腐antisepsis

它是一種抑菌作用。利用某些理化因子，使物體內(nèi)外的微生物暫時(shí)處于不生長繁殖但又未死亡的狀態(tài)。這是一種防止食品腐敗和其他物質(zhì)霉變的技術(shù)措施。如低溫、干燥、鹽腌、糖漬等等。

消毒disinfection

是指殺死或消除所有病原微生物的措施，可達(dá)到防止傳染病傳播的目的。例如將物體煮沸10min，就可殺死病原菌的營養(yǎng)體，但不能殺死細(xì)菌的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物體表面的消毒。第五節(jié)微生物的控制

滅菌sterilization

是指用物理或化學(xué)因子，殺滅物體中的所有生活微生物，包括最耐熱的細(xì)菌芽孢。這是一種徹底的殺菌措施。通過滅菌的物品不再存在任何有生命的有機(jī)體。

化學(xué)治療chemotherapy

是指利用某些具有選擇毒性的化學(xué)藥物(如磺胺)或抗生素，對(duì)生物體的深部感染進(jìn)行治療，可以有效地消除宿主體內(nèi)的病原體，但對(duì)宿主卻沒有或基本上沒有損害。

不同微生物的致死溫度不同：多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、霉菌的營養(yǎng)細(xì)胞和病毒，在50~65℃條件下12min可致死；放線菌和霉菌孢子比營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性強(qiáng)，76~80℃條件下10min才被殺死；細(xì)菌芽孢抗熱性最強(qiáng)，100℃以下處理相當(dāng)長時(shí)間才能致死。例如肉毒梭菌的芽孢沸水中5.0-9.5小時(shí)才被殺死。

同一菌種不同菌株或不同菌齡，其抗熱性也可能不同一般幼齡的比老齡的對(duì)熱敏感。例如菌齡為1.75h和2.75h的大腸桿菌在53℃加熱15min，其菌數(shù)分別下降10，000倍和2，000倍，而菌齡為62h，在同樣條件下菌數(shù)只下降12倍。同一種微生物在生長發(fā)育的不同階段，對(duì)溫度的要求不一樣:

例如：灰色鏈霉菌的菌體最適生長溫度為37℃，而產(chǎn)生鏈霉素的最適生長溫度為28℃。又如：青霉素產(chǎn)生菌菌體的最適生長溫度為30℃，而產(chǎn)生青霉素的最適溫度為23℃。又如：黑曲霉菌體生長的最適生長溫度為37℃，而產(chǎn)酶的溫度為28℃。又如：人工栽培的食用菌菌絲生長的最適溫度為25℃左右，而子實(shí)體分化的溫度通常大都在18℃左右。

培養(yǎng)基的成分對(duì)微生物的抗熱性也有影響。例如在富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌，可能由于在菌體周圍形成了一層蛋白質(zhì)膜而提高了抗熱能力。

一、高溫殺菌

1、干熱滅菌①焚燒滅菌法此法滅菌徹底，迅速簡便，但使用范圍有限。常用于接種工具、污染物品以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體等廢棄物的處理。②干熱滅菌法主要在干燥箱中利用熱空氣進(jìn)行滅菌。通常160~170℃處理2h便可達(dá)到滅菌的目的。此法只適用于玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品的滅菌。其優(yōu)點(diǎn)是可保持物品干燥。濕熱滅菌①煮沸消毒法物品在水中煮沸15min以上，可殺死細(xì)菌的所有營養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢。這種方法適用于注射器、解剖用具等的消毒。②高壓蒸汽滅菌法是實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)中常用的滅菌方法。加壓則可提供高于100℃的蒸汽。加之蒸汽熱穿透力強(qiáng)，可迅速引起蛋白質(zhì)凝固變性。所以高壓蒸汽滅菌在濕熱滅菌法中效果最佳、應(yīng)用較廣。一般培養(yǎng)基、各種緩沖溶液、玻璃器皿等常采用此方法滅菌，其工藝條件為:0.1Mpa/cm2(121℃)處理30min手提式滅菌鍋的使用方法：1、加水2、裝鍋3、加熱和排除冷空氣4、升壓保壓、計(jì)時(shí)5、降壓排汽6、出鍋滅菌鍋冷空氣排除程度與鍋內(nèi)溫度的關(guān)系

③間歇滅菌法

常壓下100℃處理15~30min，以殺死其中的營養(yǎng)細(xì)胞。冷卻后，置于一定溫度(28~37℃)保溫過夜，使其中可能殘存的芽孢萌發(fā)營養(yǎng)細(xì)胞，再以同樣方法加熱處理。如此反復(fù)三次，可殺滅所有芽孢和營養(yǎng)細(xì)胞，以達(dá)到滅菌的目的。此法的缺點(diǎn)是滅菌比較費(fèi)時(shí)，在缺乏高壓蒸汽滅菌設(shè)備時(shí)可用此方法滅菌。④巴斯德消毒法用較低的高溫處理牛奶、酒類等飲料，以殺死其中的病原菌如結(jié)核桿菌、傷寒桿菌等，但又不損害營養(yǎng)與風(fēng)味。巴氏消毒法的工藝條件為：

62~63℃/30min或71℃/15min

這種方法只能殺死大多數(shù)腐生菌的營養(yǎng)體而對(duì)芽孢無損害。此法是基于結(jié)核桿菌致死溫度為62℃/15min而規(guī)定的。

微生物的致死溫度在一定時(shí)間內(nèi)（如10min）殺死微生物所需要的最低溫度稱為微生物的致死溫度。微生物的致死時(shí)間在一定溫度下殺死微生物所需要的最短時(shí)間稱為微生物的致死時(shí)間。溫度愈高，致死時(shí)間愈短。D值decimusvalue

在特定溫度下使微生物菌數(shù)減少10倍所需的時(shí)間。輻射是指通過空氣或外層空間以波動(dòng)方式從一個(gè)地方傳播或傳遞到另一地方的能源。它們或是離子或是電磁波。電磁輻射包括可見光、紅外線、紫外線、X射線和γ射線等可見光只有光能營養(yǎng)型的微生物才需要400~800nm可見光進(jìn)行光合作用。有的微生物對(duì)光有趨光性，如閃光須霉。擔(dān)子菌形成子實(shí)體也需要散射光的照射。微生物細(xì)胞經(jīng)照射后，在有氧情況下，產(chǎn)生光化學(xué)氧化反應(yīng)，生成H2O2，能發(fā)生強(qiáng)烈氧化作用，引起細(xì)胞死亡。二、輻射

紫外線紫外線對(duì)微生物有殺傷作用，UV的波長在136~400nm之間，以波長為265~266nm的殺菌力最強(qiáng)。在醫(yī)療衛(wèi)生和無菌操作中廣泛應(yīng)用。紫外線穿透能力差，只適用于空氣及物體表面消毒。紫外輻射的殺菌機(jī)制復(fù)雜，最明顯的是形成胸腺嘧啶二聚體。

UV照射引起的微生物損傷在有光時(shí)可在DNA修復(fù)酶的作用下進(jìn)行修復(fù)，此稱為光復(fù)合作用，所以微生物經(jīng)UV照射后應(yīng)放在黑暗處，特別是在誘變育種中。電離輻射

X射線與α射線、β射線和γ射線均為電離輻射。它們的波長很短（X射線0.06~13.6nm；γ射線0.01~0.14nm）有足夠的能量從分子中逐出電子而使之電離。電離輻射的殺菌作用通過射線引起細(xì)胞中水分子在吸收能量后導(dǎo)致電離所產(chǎn)生的自由基起作用。

γ射線是由某些放射性同位素如60Co發(fā)射出的高能輻射，具較強(qiáng)的穿透力，能致死所有的生物?，F(xiàn)已制出了用于不耐熱的大體積物品消毒的γ射線裝置。干燥會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失水而造成代謝停止以至死亡。不同微生物種類，干燥時(shí)微生物所處的環(huán)境條件，干燥的程度均影響干燥對(duì)微生物的效果。結(jié)核分枝桿菌特別耐干燥，在此環(huán)境中，100℃20min仍能生存；鏈球菌用干燥法保存幾年而不喪失致病性。休眠孢子抗干燥能力也很強(qiáng)，在干燥條件下可長期不死，這一特性已用于菌種保藏。生產(chǎn)或科研中常用真空干燥法來保藏細(xì)菌、病毒及立克次氏體。在日常生活中常用烘干、曬干和熏干等方法來保存食物。

三、干燥四、滲透壓若置微生物于高滲溶液(如20%NaCl)中，水將通過細(xì)胞膜從細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞周圍的溶液中，造成細(xì)胞脫水，使細(xì)胞不能生長甚至死亡。相反，若將微生物置于低滲溶液(如0.01%NaCl)或水中，外環(huán)境中的水將從溶液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞膨脹，甚至使細(xì)胞破裂。由于一般微生物不能耐受高滲透壓，所以日常生活中常用的高濃度的鹽或糖保存食物，如腌漬蔬菜、肉類及蜜餞等。糖的濃度通常為50~70%，鹽的濃度為10~15%。五、超聲波超聲波(頻率在20000Hz以上)具有強(qiáng)烈的生物學(xué)作用。超聲波的作用是使細(xì)胞破裂，幾乎所有的微生物都能受其破壞，其效果與頻率、處理時(shí)間、微生物種類、細(xì)胞大小、形狀及數(shù)量等均有關(guān)系。淋病奈氏球菌對(duì)超聲波極為敏感，而發(fā)光細(xì)胞卻要處理1.5h才死亡。病毒的抗性較強(qiáng)。一般來說，高頻率比低頻率殺菌效果好，球菌較桿菌抗性強(qiáng)。細(xì)菌芽孢具更強(qiáng)的抗性，大多數(shù)情況下不受超聲波影響?？蒲兄谐Ｓ么朔ㄆ扑榧?xì)胞。六、化學(xué)藥物

最低抑制濃度（MIC）：在一定條件下，某化學(xué)藥劑抑制特定微生物的最低濃度。半致死劑量（LD50）：在一定條件下，某化學(xué)藥劑能殺死50％實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)的劑量。最低致死劑量（MLD）：在一定條件