細(xì)胞骨架染色

實驗七：細(xì)胞骨架觀察

一.考馬斯亮藍(lán)R250染色法觀察微絲二.甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色法觀察微絲精選課件一.考馬斯亮藍(lán)R250染色法觀察微絲掌握觀察動物細(xì)胞內(nèi)微絲的方法:考馬斯亮藍(lán)R250染色法

實驗?zāi)康木x課件真核細(xì)胞胞質(zhì)中有錯綜復(fù)雜的纖維網(wǎng),稱為細(xì)胞骨架。根據(jù)纖維的直徑分為微絲,微管和中間纖維。此外,還散布著一些比微絲還細(xì)的纖維。本實驗觀察的是由微絲平行排列組成的纖維束,在動物細(xì)胞里稱作”應(yīng)力纖維”.應(yīng)力纖維在體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞中尤其發(fā)達(dá)。一般當(dāng)細(xì)胞充分鋪展時,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色,可看到沿細(xì)胞長軸伸展的粗大纖維束,此即應(yīng)力纖維。實驗原理精選課件儀器、材料和試劑（一）儀器

光學(xué)顯微鏡,溫箱,細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（二）材料平皿,直徑30mm小染缸,載玻片,蓋玻片,體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞B-cap細(xì)胞。（三）試劑細(xì)胞培養(yǎng)基,磷酸緩沖液(PBS,PH7.4);0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.3);M-緩沖液;1％Triton×-100(用M-緩沖液配);0.2％考馬斯亮藍(lán)R250;3.0％戊二醛(用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制)。精選課件實驗步驟1.細(xì)胞培養(yǎng)在平皿中的蓋玻片上,尚未致密時即可使用。取出蓋玻片,用PBS洗滌3次。2.用1％Triton×-100處理25-30min,室溫或37℃均可。3.立即用M-緩沖液輕輕洗細(xì)胞3次。4.略晾干后,用3.0％戊二醛固定細(xì)胞5-15min。精選課件5.PBS洗數(shù)次,濾紙吸干。6.用0.2％考馬斯亮藍(lán)R250染片子1h。然后小心用水沖洗,蒸餾水沖洗,空氣中略干燥。7.普通光學(xué)顯微鏡下用40×物鏡或油鏡觀察。應(yīng)力纖維成深藍(lán)色。實驗步驟精選課件注意事項

1.洗片時要輕柔，以免把細(xì)胞從載片上洗去。

2.細(xì)胞蓋片注意正反面。

3.染色后應(yīng)沖洗蓋片背面，避免損傷細(xì)胞。

精選課件實驗報告1.畫出你所觀察到的微絲圖像。2.對實驗成功失敗的原因進行討論。精選課件思考題微絲觀察實驗中,1％Triton×-100處理細(xì)胞的作用是什么?此實驗是否能看到微管,中間纖維?為什么?M-緩沖液的作用是什么?精選課件二.甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色法觀察微絲掌握觀察動物細(xì)胞內(nèi)微絲的方法:甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色法。實驗?zāi)康木x課件鬼筆環(huán)肽是雙環(huán)桿肽,與微絲有強烈的親和作用，能使F-actin穩(wěn)定。用熒光燃料甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以清晰地顯示細(xì)胞中的微絲。實驗原理精選課件（一）儀器

熒光顯微鏡（二）材料平皿,直徑30mm小染缸,載玻片,蓋玻片,鋁盒,體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞如B-cap細(xì)胞。（三）試劑細(xì)胞培養(yǎng)基,3.7％甲醛-PEMD,磷酸緩沖液(PBS,PH7.4),丙酮,甲基羅丹明-鬼筆環(huán)肽染液,甘油-PBS(9:1)。儀器、材料和試劑精選課件1.細(xì)胞培養(yǎng)在平皿中的蓋玻片上,當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)70-80％時取出放進小染缸中,PBS洗滌。2.3.7％甲醛-PEMD室溫固定10min,用PBS洗去固定液后,略干燥再放入預(yù)冷的-20℃丙酮中再固定3-5min,取出略干燥。3.用甲基羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色:滴加20μL染液在清潔的載玻片上,將蓋玻片上的細(xì)胞樣品反扣其上,放入濕盒內(nèi),置暗處室溫下染色20-2