生物素-過氧化物酶講課教案

生物素-過氧化物酶第一節(jié)生物素－親和素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一、基本原理（一）生物素（Biotin）與親和素/卵白素/抗生物素（Avidin/anti-Biotin）之間有很強(qiáng)的親和力；（二）生物素和親和素具有與其它示蹤物質(zhì)如熒光素和過氧化物酶等相結(jié)合的能力。二、幾種經(jīng)典的抗生物素－生物素染色法（一）ABC（AvidinBiotin-peroxidaseComplex

）技術(shù)（二）LAB（LabelledAvidin-Biotin）技術(shù)（三）LSAB（labeledstreptavidinbiotinmethod）：

S-P（streptavidin－peroxidase）技術(shù)

SABC（streptavidin-biotincomplex）技術(shù)（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin

）技術(shù)（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法

（六）Envision技術(shù)（一）親和素-生物素-過氧化物酶（AvidinBiotin-peroxidaseComplex，ABC）技術(shù)

1．基本原理2、操作步驟（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，冰凍切片經(jīng)冷丙酮固定，用PBS洗；（2）用3%H2O2甲醇液室溫作用20min后，充分水洗；（3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗動物種屬正常血清15min；（4）加第一抗體（即用型或濃縮型）4℃過夜或37℃1h；（5）PBS洗，加生物素化第二抗體37℃30min；（6）PBS洗，加ABC復(fù)合物（1∶100,使用前30min將等量的親和素和酶標(biāo)生物素混合，稀釋配制成ABC復(fù)合物),37℃20min；（7）PBS洗，經(jīng)DAB/H2O2顯色；（8）常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。3、ABC法的優(yōu)點(diǎn)（1）敏感性高:結(jié)合力強(qiáng),分子量小;（2）特異性強(qiáng)，背景染色淡；（3）方法簡便，節(jié)約時間；（4）由于生物素與抗生物素具有與多種標(biāo)記物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。（二）標(biāo)記生物素-抗生物素技術(shù)（LabelledAvidin-BiotinTechnique,LAB技術(shù)）

1、基本原理以生物素標(biāo)記抗體作第一抗體，酶標(biāo)記抗生物素作為第二抗體，同S-P技術(shù)

LAB法示意圖2、操作步驟（1）①-④步驟與ABC法相同；（5）PBS洗后加生物素標(biāo)記第一抗體37℃30min；（6）PBS洗后加酶標(biāo)親和素（如HRP-Avidin）37℃30min：（7）以下步驟同ABC法。

（三）LSAB（labeledstreptavidinbiotin）技術(shù)：S-P（streptavidin－peroxidase）技術(shù)

SABC（streptavidin-biotincomplex）技術(shù)

1、基本原理2、操作步驟（1）常規(guī)切片脫蠟至水；（2）必要時抗原修復(fù)：如高溫高壓修復(fù)；（3）3%H2Ｏ2甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15min；（4）水洗，PBS洗，10%牛血清白蛋白20min；（5）加一抗4℃過夜或37℃孵育1h；（6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃30min；（7）PBS洗，滴加HRP標(biāo)記鏈霉親和素（S-P復(fù)合物）或鏈霉親和素－生物素（SABC），37℃孵育20min；（8）DAB/H2Ｏ2顯色，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封固。（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin

）技術(shù)1、原理以生物素標(biāo)記抗體作第一抗體，抗生物素作為第二抗體，橋接酶標(biāo)生物素。

2、操作步驟（1）①-③步驟與ABC法操作相同；（2）加一抗4℃過夜或37℃1h；（3）PBS洗后加生物素標(biāo)記的第二抗體37℃30min；（4）PBS洗后加親和素37℃孵育30min；（5）PBS洗后加HRP酶標(biāo)記生物素37℃30min；（6）PBS洗后用DAB/H2Ｏ2顯色；（7）常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封固。（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法

1、原理根據(jù)兩次生物素-Streptavidin-HRP反應(yīng)，聚合示蹤物質(zhì)（HRP催化底物生物素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信號得到幾何級放大，敏感性更高，尤其適合原始信號較弱的信號檢測，但操作較復(fù)雜。第一步第二步第三步第四步第五步2、操作步驟（1）常規(guī)脫蠟至水，必要時用抗原修復(fù)處理；（2）3%H2Ｏ2甲醇液15min；（3）正常封閉血清，室溫20min，甩干；（4）滴加特異性一抗4℃過夜或37℃孵育1h；（5）PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃30min；（6）PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育20min；（7）PBS洗，滴加生物素化酪胺基團(tuán)分子，37℃孵育20min；（8）PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育20min；（9）PBS洗后，DAB/H2Ｏ2顯色；（10）蘇木素襯染細(xì)胞核，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。（六）Envision技術(shù)１、原理用高分子的葡聚糖作為載體，將大量的二抗分子和HRP結(jié)合成多聚體，具有很強(qiáng)的信號放大功能，對膜和漿表達(dá)的抗體特別敏感。敏感，簡便。2、操作步驟（1）組織切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗；（2）用3%H2Ｏ2甲醇液阻斷15min，水洗，PBS洗；（3）抗原修復(fù)處理，PBS洗；（4）正常山羊血清封閉15min；（5）滴加第一抗體，37℃孵育1h；（6）PBS洗（一定要充分），滴加HRP-聚合物-抗體復(fù)合物37℃，60min；（7）PBS洗（一定要充分），DAB顯色；（8）蘇木素襯染，脫水、透明、封固。附免疫多染技術(shù)原理用不同來源的抗體和不同的染色同時檢測同一標(biāo)本中的多種抗原標(biāo)記物。第二節(jié)葡萄球菌A蛋白（SPA）的應(yīng)用葡萄球菌A蛋白（staphylococalproteinA，SPA）一、特性：

1、多肽單鏈蛋白，對熱和變性劑十分穩(wěn)定；2、能與某些哺乳動物IgG的Fc段特異性結(jié)合；3、可以被各種標(biāo)記物所結(jié)合，形成SPA標(biāo)記物。二、應(yīng)用

SPA主要在免疫組織化學(xué)中替代連接抗體（橋抗體），可不受動物種屬限制。三、常見問題及處理

主要是無信號、信號弱、雜信號等三種。當(dāng)免疫組化染色沒有出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果時，應(yīng)系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。一定設(shè)對照，主要是陰性對照和陽性對照。（一）無信號染色結(jié)果陽性對照/標(biāo)本均無染色，出現(xiàn)無信號染色現(xiàn)象有兩種原因：

1、真陰性結(jié)果：組織或細(xì)胞不表達(dá)抗原，無法檢測到相關(guān)信號；或表達(dá)抗原太低，所使用檢測系統(tǒng)不足以達(dá)到檢測所需要的靈敏度。

2、假陰性結(jié)果：原因有兩種：

（1）染色前錯誤：切片時選錯蠟塊和選錯切片，這種情況可用H&E染色驗(yàn)證。

（2）染色中錯誤：

①確認(rèn)是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等；

②確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間；

③對照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點(diǎn)是非常重要的；④檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體，要求在4~8℃條件下保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，一定要避免與揮發(fā)性有機(jī)溶劑同放一室，以免降低抗體的效價；⑤檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液是否合適；⑥確定標(biāo)本的處理及儲存條件；⑦檢查色原/底物溶液，底物在制成工作液后應(yīng)在一定時間內(nèi)用完，否則會失效；

⑧檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉；⑨檢查復(fù)染劑、脫水、透明和封片劑是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性樹膠，熒光素用水溶性封片劑，AEC等不能用二甲苯有機(jī)溶劑透明。

（二）信號弱如果陰性對照沒有染色而陽性對照標(biāo)本弱陽性，除了上述因素外，還有：

1.標(biāo)本的固定方式，不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高；2.抗原修復(fù)方式不當(dāng)；3.抗原位于細(xì)胞內(nèi)，未使用穿孔劑如0.05%TritonX-100或EDTA，有助于抗體滲透入細(xì)胞內(nèi)，也可降解內(nèi)源性Fc受體；4.抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確；5.切片上遺留了過多的沖洗液，；6.孵育時切片是否放置水平，否則會導(dǎo)致抗體流失。三、雜信號由于切片、內(nèi)源性IgG、Fc受體、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素的存在等原因，同時組織在處理過程中如高溫修復(fù)也會使更多的內(nèi)源性生物素暴露，造成染色組織上會出現(xiàn)非抗原部位的非特異性染色、邊緣效應(yīng)等雜信號。原因分析如下：（一）全片著色

1.是否有效地去除了內(nèi)源性酶和生物素；2.封閉液的使用：是否選擇使用了正確的封閉血清；3.所選擇的抗體是否符合試驗(yàn)要求，主要是抗體純度；4.一抗的使用濃度是否過高；5.清洗是否充分，DBA的使用是否正確，邊緣效應(yīng)；6.檢查二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白是否有交叉反應(yīng)；7.組織抗原彌散等。（二）部分著色1.灶片裝著色：切片撈片時應(yīng)一步到位，避免產(chǎn)生氣泡，組織局部鼓起。

2.陰陽著色：測試片未放平，滴加試劑偏向一側(cè)。

（三）著色部位改變

1.間質(zhì)著色：原因很多：抗體與組織中的蛋白質(zhì)因疏水基團(tuán)相互作用形成非特異性的連接造成，血清封閉可避免此中影響因素；靶抗原外溢到組織間隙；抗體不純或被污染；2.細(xì)胞漿著色：內(nèi)源性物質(zhì)殘留如酶、生物素或產(chǎn)生非特異性吸附的蛋白；3.細(xì)胞核著色：不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲苯、緩沖液中浸泡時間過長、組織變干、修復(fù)液pH值和修復(fù)時間不當(dāng)、組織沒有浸沒在修復(fù)液中等。四、石蠟切片免疫組化染色步驟

1、載玻片的處理：

抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的正常進(jìn)行，可選用防脫片試劑，對已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：

1.1APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。1.2HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。1.3Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。2、常用酶消化：2.1胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。2.2胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），CollagenIV（IV型膠原）等。2.3皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。

3、抗原熱修復(fù)：

可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。其pH值在6.00.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調(diào)整，常用方法如下：3.1石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：

切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3.2石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：

切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鐘后），計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

3.3石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：

切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。五、冰凍切片免疫組化染色步驟冰凍切片4~8m，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。下接免疫組化染色操作步驟。六、細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟

PBS洗去貼片殘余物，入1:1的4℃丙酮:無水乙醇混合固定液固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化