實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作

實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（一）PCR簡(jiǎn)介1.即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）誕生于1985年，是根據(jù)生物體內(nèi)DNA復(fù)制的某些特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的在體外對(duì)特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增的一項(xiàng)技術(shù)。美國(guó)Cetus公司的KaryMullis發(fā)明了該技術(shù)（1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）。2.操作過程的簡(jiǎn)化依賴于以下兩項(xiàng)技術(shù)：1）熱穩(wěn)定性TaqDNA聚合酶的應(yīng)用；2）自動(dòng)化熱循環(huán)儀的設(shè)計(jì)成功。3.該項(xiàng)技術(shù)對(duì)分子生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等產(chǎn)生了革命性的影響。實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作體內(nèi)DNA復(fù)制過程的體外模擬實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（二）基本原理1．PCR的特征： 能大量擴(kuò)增特定序列，引物結(jié)合位置將決定擴(kuò)增的DNA序列。2．PCR包括3個(gè)熱循環(huán)過程：1）雙鏈DNA的高溫變性（解鏈）；2）引物與模板的低溫退火（引物與模板結(jié)合）；3）適宜溫度下的引物延伸（互補(bǔ)鏈的合成）。PCR擴(kuò)增時(shí)，靶DNA序列產(chǎn)量隨著循環(huán)次數(shù)呈指數(shù)增加，從而達(dá)到迅速大量擴(kuò)增的目的。實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作3.擴(kuò)增過程熱預(yù)變性高溫變性適溫延伸低溫退火補(bǔ)償延伸實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作4.PCR原理：第一循環(huán)引物模板DNA雙鏈模板DNA單鏈實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作前兩個(gè)循環(huán)實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作前三個(gè)循環(huán)目標(biāo)分子實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作計(jì)算表明：用基因特異性引物擴(kuò)增目的基因時(shí)，若假設(shè)開始模板分子數(shù)為x，經(jīng)過n個(gè)循環(huán)后，目的分子個(gè)數(shù)為x(2n-2n)實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作(三)反應(yīng)體系模板DNA；引物對(duì)；4種脫氧核苷三磷酸；耐熱DNA聚合酶；適宜的緩沖液。實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作1．模板DNA(template)：?jiǎn)捂淒NA或雙鏈DNA，cDNA注意事項(xiàng)：1）用DNA粗制品做樣品，應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)等；2）要被擴(kuò)增的DNA特定序列不需要事先從樣品中分離純化，因?yàn)镻CR產(chǎn)物的序列，即反應(yīng)的特異性，是由寡核苷酸引物序列所決定的。

3）PCR所需的DNA模板量較低。實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作2．引物：primer1)概念：是指兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列側(cè)翼片段互補(bǔ)的寡核苷酸。引物序列決定了PCR擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度、位置和結(jié)果。2）引物設(shè)計(jì)上的基本原則：a:一般為20~30bp；b:G+C含量：應(yīng)在45%~55%之間；c:堿基分布的隨機(jī)性；d:引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列；e:引物之間：兩個(gè)引物之間不形成引物二聚體；f:特異性：與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于10%，或少于連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基；g:引物的3’端：3’端不應(yīng)發(fā)生錯(cuò)配；實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作3．4種dNTPs：靶DNA序列的擴(kuò)增原料。注意事項(xiàng)：1）dNTPs貯存液pH值應(yīng)為7.0；2）每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50~200μmol/L為宜。3）4種dNTPs的濃度應(yīng)相同。實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作4．DNA聚合酶1）Klenow片段：又叫Klenow聚合酶或polI大片段酶。 它能識(shí)別和消除錯(cuò)配的引物末端，以校正復(fù)制過程中錯(cuò)配的核苷酸。缺點(diǎn)：反應(yīng)溫度為37℃2）TaqDNA聚合酶：最初是從美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)溫泉中發(fā)現(xiàn)的一種嗜熱菌——水生棲熱菌（Thermus

aquatics）YT菌株中分離而得。此酶的最適作用溫度為72℃。實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（四）循環(huán)參數(shù)1．變性溫度和時(shí)間 原則上變性步驟應(yīng)高溫，短時(shí)，既要保證變性充分，又要保持聚合酶在整個(gè)反應(yīng)中的活性。2．退火溫度： 退火溫度和時(shí)間取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其在反應(yīng)體系中的濃度。通常反應(yīng)條件為55℃。3．引物延伸1）引物延伸溫度：TaqDNA聚合酶通常為72℃。2）延伸步驟的時(shí)間：1000bp/min。4．循環(huán)次數(shù)：一般為25-40個(gè)周期。實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（五）PCR擴(kuò)增儀1．機(jī)械自動(dòng)裝置：固定溫度控制部分，依據(jù)每一個(gè)保溫階段對(duì)溫度的要求，將樣品在三個(gè)控溫部分之間模擬手工操作進(jìn)行機(jī)械移動(dòng)。

左到右有三個(gè)恒溫水浴鍋95度52度72度實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作2．溫度循環(huán)裝置：整個(gè)PCR過程中，樣品在樣品臺(tái)上保持相同的物理狀態(tài)，而用一軟件控制的加熱/冷卻系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)周期性溫度改變及恒溫過程的自動(dòng)化。實(shí)驗(yàn)?zāi)空莆誔CR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（六）實(shí)驗(yàn)操作1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建（總體積：20.0μl）反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)加入量（μl）實(shí)際加入量（μl）10×buffer2.064×dNTPs（10μMeach）0.44模板1.01正向引物0.83