細(xì)胞產(chǎn)物分析技術(shù)-4色譜分離分析方法-2011

第四章色譜分析技術(shù)氣相色譜法高效液相色譜法氣相色譜法氣相色譜法（gaschromatography，GC）,以氣體作為流動(dòng)相的色譜分析方法,這種氣體被稱為載氣。一般可分為氣液色譜法和氣固色譜法兩種。氣相色譜法氣/固色譜主要用于分離常溫下的氣體和低沸點(diǎn)的有機(jī)物。試樣由載氣帶入柱子后，立即被吸附劑所吸附。載氣不斷流過吸附劑時(shí)，被吸附的組分又被洗脫下來，這一過程被稱為脫附。試樣中各組分的性質(zhì)不同，在吸附劑上的吸附能力有差別，較難被吸附的組分容易脫附，移動(dòng)速度快，先流出色譜柱。組分經(jīng)多次反復(fù)吸附、脫附而彼此分離，先后流出色譜柱。氣相色譜法氣/液色譜氣/液色譜應(yīng)用更為廣泛，實(shí)際工作中高達(dá)80％的樣品使用氣/液色譜。試樣由載氣帶入柱子后，被固定液所溶解。載氣不斷流過時(shí)，被分離組分在固定液中溶解度不同，經(jīng)反復(fù)分配達(dá)到分離。氣相色譜法氣相色譜法（1）載氣系統(tǒng)（2）進(jìn)樣系統(tǒng)（3）色譜柱和柱箱（4）檢測系統(tǒng)（5）記錄系統(tǒng)氣相色譜法儀器組成載氣系統(tǒng)包括氣源、凈化器、氣體流量控制和測量等部件，載氣在壓力梯度的作用下在柱內(nèi)運(yùn)行，要求載氣干燥純凈、流量穩(wěn)定。進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣器、汽化室，將試樣引入色譜柱并使常溫下為液體的試樣在汽化室瞬間汽化。進(jìn)樣系統(tǒng)的出口由硅橡膠隔膜密封，樣品通過注射器刺穿隔膜注入系統(tǒng)。填充柱的進(jìn)樣量一般為0.5～20μl。氣相色譜法儀器組成色譜柱和柱箱包括溫度控制裝置，混合試樣在此進(jìn)行分離。短柱可以直線形或U形柱放入柱箱，較長柱則盤繞成螺旋狀。柱子使用前必須在載氣流中充分加熱老化，以達(dá)到除去殘余溶劑或活化硅膠或分子篩的作用。檢測系統(tǒng)包括檢測器、檢測器的電源及控制裝置，對(duì)柱后已被分離的組分進(jìn)行鑒定與測量。記錄系統(tǒng)包括放大器、記錄儀和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，記錄由檢測器產(chǎn)生的信號(hào)，以便對(duì)試樣進(jìn)行定性、定量分析。氣相色譜法常用術(shù)語基線（baseline）：當(dāng)色譜柱后沒有組分進(jìn)入檢測器時(shí)，記錄到的信號(hào)稱為基線。它反映了檢測器系統(tǒng)噪聲隨時(shí)間的變化。穩(wěn)定的基線是一條水平直線。保留時(shí)間（retentiontime）：從進(jìn)樣開始到柱后被測組分出現(xiàn)濃度最大值所需時(shí)間，以tR表示。保留體積（retentionvolume）：從進(jìn)樣開始到柱后被測組分出現(xiàn)濃度最大值時(shí)流動(dòng)相所通過的體積，用VR表示。氣相色譜法常用術(shù)語相對(duì)保留值（relativeretentionvalue）。在相同條件下，組分2與組分1的調(diào)整保留值之比，用r21表示。只要柱溫、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)保持不變，即使柱長、柱徑、填充情況及流動(dòng)相流速有所變化，其比值仍基本保持不變，所以它是色譜定性分析的重要參數(shù)。相鄰兩組分的tr’或VR’相差越大，兩峰相距越遠(yuǎn)，分離程度越好，r21值也越大，當(dāng)r2l=1時(shí)，兩組分不能分離。r21也可以用來表示色譜柱固定相的選擇性，因此r21也被稱作選擇因子。氣相色譜法常用術(shù)語死時(shí)間（deadtime）：不被固定相滯留的組分（如空氣、甲烷等）從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需時(shí)間，用tM表示。它表示不被固定相滯留的組分在柱內(nèi)空隙中運(yùn)行所耗費(fèi)的時(shí)間，正比于色譜柱的空隙體積。死體積（deadvolume）：不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣開始到往后出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所需流動(dòng)相的體積，用VM表示。它表示色譜柱在填充后柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間總和。氣相色譜法常用術(shù)語半峰寬(peakwidthathalf-height)Y1／2。又稱半寬度或區(qū)域?qū)挾?，即峰高為一半處的寬度。由于Y1/2易于測定，使用方便，常用它表示區(qū)域?qū)挾?。峰底寬?peakwidthatpeakbase)Y,自色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)所作切線在基線上截距間的距離。氣相色譜法塔板理論(platetheory)該理論把整個(gè)色譜柱比擬成精餾塔，把色譜分離過程比擬作精餾過程。色譜柱由長度為H的許多小段組成，猶如精餾塔由許多塔板所組成一樣。在每小段距離H內(nèi)達(dá)成一次汽液平衡，相當(dāng)于在精餾塔中一塊塔板上完成一次分離，色譜柱的這一小段距離H稱為理論塔板高度(height

equivalenttotheoreticalplate)。柱的分離效果用理論塔板數(shù)n(numberoftheoreticalplates)表示。n值越大，表示達(dá)成汽液平衡的次數(shù)越多，分離發(fā)生的機(jī)會(huì)也越多，柱效越好。氣相色譜法分離度R(resolution)相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰底寬度之和的一半的比值。分子是兩組分峰間的距離，分母是色譜峰寬窄的度量，R值越大，相鄰兩組分分離得越好。分離度綜合這兩個(gè)因素，可作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)。當(dāng)R≤1時(shí)，分離程度小于98％，兩組分有明顯交疊；當(dāng)R≥1.5時(shí)，分離程度可達(dá)99.7％，因此以R＝1.5作為相鄰兩峰已完全分開的標(biāo)志。氣相色譜法分離度R(resolution)選擇性好(色譜峰間的距離相差較大)柱效高(色譜峰要盡可能窄)氣相色譜法氣相色譜柱填充柱：是將色譜固定相填充到柱中的分離柱，色譜柱內(nèi)充滿細(xì)顆粒的填充物(packing)，載氣在填充物間縫隙孔道內(nèi)通過，柱的滲透性比較差。毛細(xì)管柱又叫空心柱，分為涂壁、多孔層毛細(xì)管柱。涂壁空心柱是在其管內(nèi)壁上涂漬固定相，載氣由管中心孔道通過。由于這種柱的滲透性比較好，傳質(zhì)阻力小，一般可用幾十米的長柱。氣相色譜法填充柱不同吸附劑對(duì)各種氣體吸附能力的強(qiáng)弱不同。氣相色譜法填充柱氣固色譜中經(jīng)常出現(xiàn)峰形拖尾現(xiàn)象，是由于吸附劑表面不均勻而引起的。表面結(jié)構(gòu)均勻的吸附劑(如石墨化炭黑、碳分子篩等)不但使極性化合物的色譜峰不拖尾，還可以分離一些順反空間異構(gòu)體。

GDX的比表面大，為均勻的球狀體，是一種應(yīng)用日益廣泛的氣固色譜固定相。它對(duì)含羥基的化合物親和力很小，且基本按照分子質(zhì)量順序分離，水分子可在一般有機(jī)物之前出峰，峰形對(duì)稱，它常用于醇類或含水有機(jī)物的分析，并可測定其中水的含量。氣相色譜法填充柱：氣/液色譜固定相承擔(dān)固定液的化學(xué)惰性固體微粒稱為擔(dān)體，而涂漬在擔(dān)體表面上的高沸點(diǎn)有機(jī)化合物的液膜，稱為固定液。擔(dān)體提供一個(gè)大的惰性表面，使固定液在擔(dān)體表面上形成均勻薄膜，構(gòu)成氣液色譜柱中的填充物。對(duì)擔(dān)體的要求是：比表面積大，化學(xué)惰性，無吸附性或吸附性很小，熱穩(wěn)定性好，顆粒均勻，機(jī)械強(qiáng)度好。擔(dān)體大致上可分為兩大類：硅藻土擔(dān)體：紅色擔(dān)體、白色擔(dān)體；非硅藻土擔(dān)體：聚四氟乙烯擔(dān)體、玻璃微球等。氣相色譜法毛細(xì)管柱在相同的固定相和流動(dòng)相及色譜儀器性能條件下，分離柱愈長，柱效愈好。填充柱的柱長最大為10m，要提高柱效必須通過改善固定相來實(shí)現(xiàn)，這往往很困難，為解決這一問題毛細(xì)管材氣相色譜得到迅速發(fā)展。毛細(xì)管柱是用不銹鋼和玻璃材料制成內(nèi)徑小于lmm的毛細(xì)管。早期的毛細(xì)管材料由于玻璃易碎而常使用不銹鋼。自20世紀(jì)80年代用熔融二氧化硅制成的彈性石英毛細(xì)管問世后，不銹鋼毛細(xì)管柱基本不再使用。氣相色譜法毛細(xì)管柱彈性石英毛細(xì)管具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性能，而且柔韌性好，易于安裝。20世紀(jì)90年代由919支內(nèi)徑為40pm的毛細(xì)管柱組成的集束毛細(xì)管柱商品問世，使毛細(xì)管氣相色譜有更高容量和速度對(duì)有機(jī)物進(jìn)行分離分析。因此，目前毛細(xì)管柱氣相色譜法已成為有機(jī)物分離最有效的方法。氣相色譜法氣相色譜檢測器：熱導(dǎo)池檢測器熱導(dǎo)池檢測器是根據(jù)不同的物質(zhì)具有不同的熱導(dǎo)率這一原理制成的。優(yōu)點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡單，性能穩(wěn)定，通用性好，線性范圍寬，價(jià)格便宜，是應(yīng)用最廣、最成熟的一種檢測器。熱導(dǎo)池由池體和熱敏元件構(gòu)成，熱敏元件為金屬絲（鎢絲或鉑金絲）。氣相色譜法氣相色譜檢測器：熱導(dǎo)池檢測器電源提供恒定電壓加熱鎢絲，只有載氣通入時(shí)，熱敏元件溫度變化相同，電橋處于平衡狀態(tài)。進(jìn)樣后樣品氣和載氣混合通過測量臂，測量臂和參比臂帶走的熱量不相等，電橋失去平衡，記錄器上就有信號(hào)產(chǎn)生?；旌蠚怏w的熱導(dǎo)率與純載氣的熱導(dǎo)率相差越大，輸出信號(hào)就越大。

氣相色譜檢測器：氫火焰離子化檢測器(GC-FID)以氫氣和空氣燃燒作為能源，利用含碳有機(jī)物在火焰中燃燒所產(chǎn)生的高溫（約2100℃）使被測有機(jī)物組分電離成正負(fù)離子產(chǎn)生離子，在外加電場作用下，使離子流定向運(yùn)動(dòng)形成電流，根據(jù)離子流產(chǎn)生的電信號(hào)強(qiáng)度，檢測被色譜柱分離出的組分。發(fā)射極收集極噴嘴離子室氣相色譜法氣相色譜法氣相色譜檢測器：電子捕獲檢測器高選擇性、高靈敏度的濃度型檢測器，對(duì)具有電負(fù)性的物質(zhì)（如含鹵素、S、P、N）的檢測靈敏度高，檢出限約10-14g·cm－3。電負(fù)性越強(qiáng)，靈敏度越高。目前廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量、大氣及水質(zhì)污染分析，以及生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域中。氣相色譜法氣相色譜檢測器：電子捕獲檢測器在檢測器池體內(nèi)有一個(gè)簡狀β放射源（63Ni或3H）作為負(fù)極，一個(gè)不銹鋼棒作為正極。在兩極施加直流或脈沖電壓，當(dāng)載氣（一般為N2或Ar）進(jìn)入檢測器時(shí)，在β射線作用下電離，形成恒定不變的電流即基流。樣品捕獲電子而產(chǎn)生帶負(fù)電荷的分子離子并放出能量，帶負(fù)電荷的分子離子和載氣電離產(chǎn)生的正離子復(fù)合成中性化合物，由于被測組分捕獲電子導(dǎo)致基流下降，產(chǎn)生負(fù)信號(hào)而形成倒峰。氣相色譜法氣相色譜檢測器:硫、磷檢測器對(duì)含磷、硫的有機(jī)化合物具有高選擇性和高靈敏度的質(zhì)量型檢測器。對(duì)磷的檢出限可達(dá)10-12g·s-1，對(duì)硫的檢出限可達(dá)10－11g·s－1。用于大氣中痕量硫化物以及農(nóng)副產(chǎn)品、水中納克級(jí)有機(jī)磷和有機(jī)硫農(nóng)藥殘留量的測定。包括燃燒系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)兩部分。燃燒系統(tǒng)和火焰原子化器類似，也使用氫氣—空氣火焰；光學(xué)系統(tǒng)包括石英窗、濾光片和光電倍增管。氣相色譜法氣相色譜檢測器:硫、磷檢測器在氫氣—空氣焰中燃燒時(shí)，有機(jī)硫首先被氧化成以SO2，然后被氫還原成S原子并在適當(dāng)溫度下生成激發(fā)態(tài)的S2˙分子，當(dāng)激發(fā)態(tài)S2˙分子返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出特征波長為350～430nm的特征分子光譜。含磷試樣燃燒時(shí)生成磷的氧化物，然后在富氫的火焰中被氫還原成化學(xué)發(fā)光的HPO碎片，發(fā)射出526nm波長的特征光譜氣相色譜法氣相色譜檢測器:檢測器的性能指標(biāo)靈敏度（sensitivity）S，亦稱響應(yīng)值或應(yīng)答值，是當(dāng)一定濃度或一定質(zhì)量的試樣進(jìn)入檢測器，產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)R與進(jìn)樣量Q的相關(guān)性直線的斜率。響應(yīng)時(shí)間（responsetime）檢測器應(yīng)能迅速地、真實(shí)地反映通過它的物質(zhì)濃度或量的變化，即要求響應(yīng)時(shí)間短。響應(yīng)時(shí)間是指進(jìn)入檢測器的某一組分的信號(hào)達(dá)到其真值的。氣相色譜法氣相色譜檢測器:檢測器的性能指標(biāo)檢出限（detectionlimit）D當(dāng)檢測器輸出信號(hào)放大時(shí)，電子線路中固有的噪聲信號(hào)也同時(shí)被放大，使基線起伏波動(dòng)。一般認(rèn)為，只有當(dāng)信號(hào)大于三倍噪聲時(shí)，才能確認(rèn)是色譜峰的信號(hào)。檢出限就是考慮到噪聲影響而規(guī)定的一項(xiàng)指標(biāo)。它是指檢測器的響應(yīng)信號(hào)等于檢測器噪聲大小的三倍時(shí)，在單位時(shí)間或單位體積內(nèi)通過檢測器的最低樣品量（或濃度)高效液相色譜法

高效液相色譜（highperformance

liquidchromatography，HPLC）又稱高壓液相色譜（highpressureliquidchromatography），高速液相色譜（highspeedliquidchromatography）、高分離度液相色譜（highresolutionliquid

chromatography）或現(xiàn)代液相色譜modernliquidchromatography）經(jīng)過近30年發(fā)展，現(xiàn)在高效液相色譜法在分析速度、分離效能、檢測靈敏度和操作自動(dòng)化方面，都達(dá)到了和氣相色譜法相媲美的程度，并保持了經(jīng)典液相色譜對(duì)樣品適用范圍廣、可供選擇的流動(dòng)相種類多和便于用作制備色譜等優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜法使用了全多孔微粒固定相，裝填在小口徑、短不銹鋼柱內(nèi)，流動(dòng)相通過高壓輸液系進(jìn)入高柱壓的色譜儀，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度大大加快，從而在短的分析時(shí)間內(nèi)獲得高柱效和高分離能力。制備型高壓液相色譜通常用于從大量的粗提物中分離出微量成分，在制備分離的最后階段采用。為提高每次分離獲得純品的數(shù)量，制備型高壓液相色譜分離常使樣品超載。隨著高壓液相色譜儀器的普及，越來越多的天然產(chǎn)物研究工作采用了制備型高壓液相色譜分離手段。高效液相色譜法基本術(shù)語

流動(dòng)相：就是一種或多種溶劑混合的液體，通過色譜柱運(yùn)動(dòng)，攜帶被分離的組分，也就是通常所說的洗脫劑。大多數(shù)液相色譜分離是利用雙溶劑作為洗脫劑。

對(duì)于反相高壓色譜，其流動(dòng)相中的一個(gè)溶劑是水。它們與疏水的吸附劑表面不發(fā)生作用，不與組分競爭吸附劑表面的位置。對(duì)于正相高壓液相色譜，其流動(dòng)相中的一個(gè)洗脫劑往往是正己烷，也不與極性的硅膠表面相互作用。液相色譜法基本術(shù)語

固定相：就是表面帶有剛性多孔的固體顆粒，也就是我們所說的吸附劑。常見的有多孔硅膠以及多孔氧化鋁。保留值：是用來描述色譜峰在色譜圖中的位置，是色譜分離過程中的重要參數(shù)，它反映了被分離物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的分配過程。

保留時(shí)間:組分從進(jìn)樣到往后出現(xiàn)的最大點(diǎn)的時(shí)間稱之為保留時(shí)間。不被吸附（或溶解）的組分的保留時(shí)間稱之為死時(shí)間。保留時(shí)間與流動(dòng)相的流速成正比。保留體積：是用流動(dòng)相流過色譜柱的體積高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

高效液相色譜儀可分為分析型和制備型，雖然它們的性能各異，應(yīng)用范圍不同但其基本組件是相似的，對(duì)分析型商品儀器有兩種組合方式：完全緊湊的整體系統(tǒng)，其死體積小，靈敏度高，體現(xiàn)高液相色譜儀總體實(shí)用的特點(diǎn)；獨(dú)立部件的組合系統(tǒng)，其靈活性高，可根據(jù)不同的分析目的，組裝成不同的聯(lián)接方式。色譜儀系統(tǒng)流動(dòng)相1流動(dòng)相2高壓泵高壓泵混合器色譜柱進(jìn)樣器檢測器數(shù)據(jù)處理裝置高壓梯度洗脫系統(tǒng)色譜儀系統(tǒng)流動(dòng)相1流動(dòng)相2高壓泵混合器色譜柱進(jìn)樣器檢測器數(shù)據(jù)處理裝置低壓梯度洗脫系統(tǒng)色譜儀系統(tǒng)

色譜儀系統(tǒng)

高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)的作用是保證流動(dòng)相的正常工作，它是由流動(dòng)相貯罐、脫氣裝置、高壓泵和程序控制器組成。貯液罐的材料應(yīng)耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料0.5~2L。對(duì)凝膠色譜儀和制備型色譜儀，其容積應(yīng)更大些。貯液罐放置位置一般要高于泵體，以便保持一定的輸液靜壓差。使用過程貯液罐應(yīng)密閉，以防溶劑蒸發(fā)引起流動(dòng)相組成的變化，還可防止空氣中O2、CO2重新溶解于已脫氣的流動(dòng)相中。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

輸液系統(tǒng)在液相色譜中不同的流動(dòng)相其極性、濃度和黏度差異很大，可選擇的流動(dòng)相很多。在色譜柱中它不僅起沖洗作用，而且還參與分離過程對(duì)分離的影響較大。流動(dòng)相要求：①溶劑不與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)，保證色譜柱的穩(wěn)定性。②能與檢測器相匹配。③對(duì)試樣有足夠的溶解性。④不干擾試樣的回收。⑤易于清洗。

高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

輸液系統(tǒng)所有溶劑在放入貯液罐之前必須經(jīng)過0.45μm濾膜過濾，除去溶劑中的機(jī)械雜質(zhì)。對(duì)輸出流動(dòng)相的連接管路，其插入貯液罐的一端通常連有孔徑為0.45μm的多孔不銹鋼過濾器或由玻璃制成的專用膜過濾器。流動(dòng)相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體，以防止在洗脫過程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測器時(shí)因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。若在低死體積檢測池中，存在氣泡會(huì)增加噪聲，造成分析靈敏度下降。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

輸液系統(tǒng)脫氣方法（1）吹氦脫氣法

0.1MPa壓力下，約60mL／min流速10~15min。（2）加熱回流法（3）抽真空脫氣法（4）超聲波脫氣法將欲脫氣的流動(dòng)相置放于超聲波清洗中，用超聲波振蕩10～15min。但此法的脫氣效果最差。（5）在線真空脫氣法以上4種方法均為離線脫氣操作，其隨流動(dòng)相存放時(shí)間的延長又會(huì)有空氣重新溶解到流動(dòng)相中?，F(xiàn)在用的在線真空脫氣技術(shù)，把真空脫氣裝至到貯液系統(tǒng)中并結(jié)合過濾器實(shí)現(xiàn)了流動(dòng)相在進(jìn)入輸液泵連續(xù)真空脫氣。此法的脫氣效果明顯優(yōu)于上述幾種方法。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

高壓輸液泵對(duì)高壓輸液泵的要求是：①泵體材料能耐化學(xué)腐蝕，且能在高壓下連續(xù)工作。②輸出流量范圍寬。對(duì)填充柱：0～10mL／min（分析型）100mL／min（制備型）③輸出流量穩(wěn)定且重復(fù)性高。高壓輸液泵應(yīng)提供無脈沖流量，流量控制的精密度應(yīng)小于1%，最好為0.5％，重復(fù)性最好為0.5％。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

高壓輸液泵：分為恒流和恒壓兩類。恒流泵輸出恒定體積流量的流動(dòng)相。它主要有注射型泵和往復(fù)型泵兩種。往復(fù)型泵：可在高壓下連續(xù)以恒定的流量輸液。每個(gè)泵頭在活塞的輸出過程中推動(dòng)少量流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱；在吸液過程中利用單向閥從貯液罐吸入流動(dòng)相，此過程可反復(fù)、連續(xù)進(jìn)行。往復(fù)型泵的液缸容積很小，只有幾十至幾百微升。其柱塞尺寸小易于密封。柱塞、單向間的閥球和閥座使用人造紅寶石材料造價(jià)低廉，更換溶劑方便，特別適用于梯度洗脫往復(fù)型泵輸出。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

往復(fù)式泵

缺點(diǎn)：流動(dòng)相雖然是連續(xù)的恒流量的，但存在脈動(dòng)，若與對(duì)流量敏感的折光指數(shù)檢測器連接，就產(chǎn)生基線波動(dòng)，難以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析；

柱塞式往復(fù)泵的柱塞直接與流動(dòng)相接觸造成污染，使用隔膜往復(fù)泵可克服此缺點(diǎn)。另外，往復(fù)型泵長期運(yùn)轉(zhuǎn)后因流動(dòng)相含有的機(jī)械雜質(zhì)會(huì)造成單向閥的阻塞；或因單向閥的閥球磨損不能關(guān)閉單向閥，這些都會(huì)造成往復(fù)泵不能正常工作。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

程序控制器：又稱梯度洗脫裝置梯度洗脫是使流動(dòng)相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過程連續(xù)或間斷改變流動(dòng)相的組成以調(diào)節(jié)它的極性，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子，并使樣品中的所有組分可在最短的分析時(shí)間內(nèi)以適用的分離度獲得圓滿的選擇性分離。梯度洗脫技術(shù)可以提高柱效和縮短分析時(shí)間，并可改善檢測器的靈敏度。梯度裝置有兩類：低壓梯度混合體系和高壓梯度混合體系。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

程序控制器：又稱梯度洗脫裝置高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

進(jìn)樣系統(tǒng)：一般進(jìn)樣方式可以采用注射器（即停流進(jìn)樣）六通閥以及自動(dòng)進(jìn)樣。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

717自動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

色譜柱常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。一般采用直形柱管,標(biāo)準(zhǔn)填充柱技管內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，長10~50cm。填料粒度5~10μm時(shí)，柱效每米達(dá)5000~10000塊理論塔板數(shù)；填料粒度3~5μm時(shí)，柱效每米達(dá)5000~10000塊理論塔板數(shù)，柱長可減至5~10cm。柱接頭通過過濾片與色譜柱管連接，在色譜柱管的上下兩端安裝多孔不銹鋼燒結(jié)材料的過濾片，可阻擋流動(dòng)相的極小的機(jī)械雜質(zhì)以保護(hù)色譜柱。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

檢測器：用于檢測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化并由記錄儀繪出譜圖來進(jìn)行定性和定量分析。檢測器應(yīng)具備以下4個(gè)特征：①靈敏度高，對(duì)所有的溶質(zhì)都有快速響應(yīng)；②應(yīng)對(duì)流動(dòng)相流量和溫度變化都不敏感；③不引起柱外譜帶擴(kuò)展，線性范圍寬；④適用的范圍廣。在液相色譜中流動(dòng)相（溶劑）與被測組分（溶質(zhì)）的物理性質(zhì)相似所以檢測比較困難，它不可能有相當(dāng)于氣相色譜中使用的熱身池檢測器和氫火焰離子檢測器那樣的既通用又靈敏的檢測器，至今沒有一種檢測器能完全具備上列特征。高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)

高效液相色譜法色譜儀系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理裝置高壓液相色譜的分析結(jié)果除可用記錄儀繪制譜圖外，現(xiàn)已廣泛使用微處理機(jī)和色譜數(shù)據(jù)工作站采集和處理色譜分析的數(shù)據(jù)。高效液相色譜法制備型高效液相色譜半制備型分離是指色譜柱直徑8~10mm，內(nèi)裝顆粒度為10μm左右的固定相可用于1~100mg混合物樣品的分離。制備型高壓液相色譜分離大多采用恒定的洗脫劑條件這樣可減少操作中可能出現(xiàn)的問題。對(duì)于那些難分離的樣品，有時(shí)也需在分離過程中采用梯度洗脫方式。反相色譜柱適用于分離高極性和（或）水溶性化合物。在所有高壓液相色譜分離工作中，約有95％使用的是C-18反相硅膠。高效液相色譜法制備型高效液相色譜利用大直徑色譜柱進(jìn)行一次分離或利用小直徑色譜柱進(jìn)行多次分離都可獲得一定量的純化合物。當(dāng)所需純化合物的量很少時(shí)（微克級(jí)至幾毫克），可利用已有的分析型儀器，可避免由于放大所產(chǎn)生的問題。用尺寸為250mm×4.6mm的分析型色譜柱每次可進(jìn)樣5~100pg，通過多次進(jìn)樣分離，可獲得足夠的純品。例如Suzuki等報(bào)道從豆科植物羽扇豆中分離一羽扇豆生物堿時(shí)，其最后的分離步驟采用分析色譜柱進(jìn)行高壓液相色譜分離，洗脫劑為含25％甲醇的乙醚溶液:5％氨水(50:1)。高效液相色譜法在高壓液相色譜進(jìn)樣之前，需對(duì)樣品進(jìn)行過濾。使用能與注射器相連的過濾器可以方便、廉價(jià)地除去樣品中混有的顆粒狀物質(zhì)，這些顆粒狀物質(zhì)可能損壞高壓液相色譜的閥門阻塞管線或柱子入口端的濾板。短色譜柱（如50mm×4.6μm）因分離效果好也常被采用。高效液相色譜法鍵合相硅膠硅膠表面的硅羥基能與正辛醇、氰乙醇及聚乙二醇等在一定溫度下加熱脫水后主成單分子鍵合固定相（Si－O－C型），與十八烷基三氯硅烷生成烷基化學(xué)鍵合相（Si－O－Si－C型）。另外，用SOCl2將硅膠表面氯化后可與各種有機(jī)胺反應(yīng)生成具有Si－O－Si≡N鍵的各種不同極性基團(tuán)的化學(xué)鍵合相。這些鍵合相硅膠對(duì)化合物的分離具有不同的選擇性，在液相色譜中占有重要地位，井被普遍應(yīng)用于高效液相色譜。根據(jù)鍵合相硅膠的粒度，可將其用于從常壓直至高壓的各種液相分離。高效液相色譜法鍵合相硅膠高效液相色譜法色譜圖(chromatogram)：色譜柱流出物通過檢測器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖?？v坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。峰寬色譜峰(peak)：組分流經(jīng)檢測器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線基線(baseline)：經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測器測出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸峰寬（peakwidth，W)：峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩