醫(yī)學(xué)真菌感染與實驗室診斷進展課件

真菌感染與實驗室診斷進展真菌感染與實驗室診斷進展侵襲性真菌感染發(fā)展趨勢

患者年齡的增高

廣譜抗生素的應(yīng)用

更多、更復(fù)雜的醫(yī)療手段（如移植等）

高強度細胞毒性治療的應(yīng)用

免疫抑制劑的應(yīng)用

其它病因死亡率相對降低侵襲性真菌感染發(fā)展趨勢患者年齡的增高Candida條件致病菌Aspergillus機會來了！念珠菌曲霉菌Candida條件致病菌Aspergillus機會來了！念珠條件致病真菌感染危險因素國外：血液系統(tǒng)腫瘤病人

—粒細胞減少

__骨髓移植器官移植ICUHIV感染

國內(nèi):廣譜抗生素應(yīng)用ICU皮質(zhì)激素糖尿病靜脈插管條件致病真菌感染危險因素國外：國內(nèi):膿毒血癥的發(fā)病率+600%+300%+300%Martinetal,NEJM2003;348:1546膿毒血癥的發(fā)病率+600%+300%+300%Martin78798081828384858687888990919202468Aspergillusspp.Candidaspp.AllotherPrevalenceatAutopsy[%]Grolletal,JInfect1996;33:23-32.經(jīng)尸檢證實的侵襲性真菌感染787980818283848586878889909192國內(nèi)侵襲性真菌感染的發(fā)病情況中華醫(yī)學(xué)雜志2003年3月第83卷第5期國內(nèi)侵襲性真菌感染的發(fā)病情況中華醫(yī)學(xué)雜志2003年3月第832004-2008年中國5家中心的

念珠菌分布

百分比（％）真菌2004-2008年中國5家中心的

念珠菌分布

百分比（％侵襲性曲霉患者在血液科和ICU

最為常見流行病學(xué)1994-1999年法國一項前瞻性調(diào)查結(jié)果Cornetmetal.JHospinfect.2002;514:288-296侵襲性曲霉患者在血液科和ICU

最為常見流行病學(xué)1994-1混合型真菌感染的發(fā)病率也逐年上升念珠菌/曲霉混合感染8％11％12％尸檢檢出率(%)1989-1993年1994-1998年1999-2003年ChamilosG,etal.Haematological.2006;91:986-989一項對三級腫瘤監(jiān)護中心血液腫瘤患者的尸檢結(jié)果顯示混合型真菌感染的發(fā)病率也逐年上升念珠菌/曲霉混合感染8％11新近出現(xiàn)少見真菌尸檢檢出率也有所上升足放線菌鐮刀菌0.2％0.9％0.4％0.7％0.7％1.4％尸檢檢出率(%)1989-1993年1994-1998年1999-2003年ChamilosG,etal.Haematological.2006;91:986-989一項對三級腫瘤監(jiān)護中心血液腫瘤患者的尸檢結(jié)果顯示新近出現(xiàn)少見真菌尸檢檢出率也有所上升足放線菌鐮刀菌0.2％0EpidemiologyandOutcomesofCandidemiain2019PatientsClinicalInfectiousDiseases2009;48:1695–703美國PATH網(wǎng)絡(luò)：侵襲性真菌病數(shù)據(jù)庫念珠菌血癥2019例(2004-2008)念珠菌血癥菌種比例大部分患者為非粒缺患者(占92.7%)EpidemiologyandOutcomesofCEpidemiologyandOutcomeofInvasiveFungalInfectioninAdultHematopoieticStemCellTransplantRecipientsClinicalInfectiousDiseases2009;48:265–73JohnBartlett.2009ICAAC.美國PATH網(wǎng)絡(luò)：侵襲性真菌病數(shù)據(jù)庫成人HSCT患者的侵襲性真菌病(2004-2007)共234例患者發(fā)生250次侵襲性真菌感染(確診或臨床診斷)EpidemiologyandOutcomeofIn真菌感染流行特點危險因素不斷增多，發(fā)生率逐年增高白念珠菌仍然是最常見的致病菌非白念珠菌和霉菌不斷增加曲霉已成為重要的致死真菌真菌感染流行特點曲霉感染:日益嚴重的問題曲霉是繼念珠菌之后的第二常見真菌病原體雖然經(jīng)過治療，免疫抑制患者的死亡率仍達90%AndrioleVT.JAntimicrobChemother1999;44:151-162;GrollAHetal.AdvPharmacol1998;44:343-500;DenningDW.ClinInfectDis1998;26:781-805;AndrioleVT.CurrClinTopInfectDis1998;18:19-36;LinS-Jetal.ClinInfectDis2001;32:358-366;PatersonDL,SinghN.Medicine(Baltimore)1999;78:123-138.曲霉感染:日益嚴重的問題曲霉是繼念珠菌之后的第二常見真菌病深部真菌感染的診斷標準

EORTC/MSG2008修訂版宿主因素臨床特征病原學(xué)真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理學(xué)檢查血清學(xué)檢查方法（間接證據(jù)）

CSF隱球菌抗原陽性——確診

GM-test,G-test——臨床診斷ClinicalInfectiousDiseases2008;46深部真菌感染的診斷標準

EORTC/MSG2008修訂版臨床希望能鑒別念珠菌或絲狀真菌白色念珠菌或非白念曲霉菌或毛霉菌是否卡氏肺囊蟲臨床希望能鑒別念珠菌或絲狀真菌

微生物實驗室檢查真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理生理生化血清學(xué)方法分子生物學(xué)

微生物實驗室檢查真菌鏡檢

真菌標本鏡檢

最簡單也是最有用的實驗室診斷方法優(yōu)點：簡便、快速，陽性結(jié)果可確定真菌感染，陰性結(jié)果不能排除診斷。采用不染色濕片如KOH涂片或Gram染色涂片。如在無菌體液的直接鏡檢中發(fā)現(xiàn)真菌，常可確立深部真菌病的診斷。真菌標本鏡檢最簡單也是最有用的實驗室診斷方法真菌直接涂片的診斷價值

有意義的涂片結(jié)果

機體內(nèi)部標本如血液、腹水、CSF、膿腫穿刺液等

新鮮尿液見到大量菌絲及孢子

組織真菌涂片

直接鏡檢患者痰、喉或氣管分泌物陽性率為10%到30%真菌直接涂片的診斷價值

有意義的涂片結(jié)果真菌直接涂片的診斷價值診斷陽性率高BALF培養(yǎng)陽性率40％，涂片64％，涂片＋培養(yǎng)67％(AnnInternMed1997,29:535;RespirMed1992,86:243)快速:2-4hr可以報告結(jié)果有助于鑒別感染類型有隔菌絲：曲霉菌屬唑類抗真菌藥（伊曲康唑、伏立康唑）有效無隔菌絲：根毛霉屬、根霉屬、毛霉屬、犁頭霉屬、小克銀漢霉屬兩性霉素B敏感Thelancet,2003,3:230-240真菌直接涂片的診斷價值診斷陽性率高Thelancet,2真菌直接涂片的診斷價值肺毛霉菌病：真菌培養(yǎng)的陽性率不高怕“冷”組織勻漿可能會破壞毛霉菌，“假陰性”有時，直接涂片是唯一診斷手段診斷肺毛霉菌病的治療價值首選肺葉切除次選兩性霉素B（唑類抗真菌藥無效）卡氏肺孢子菌：無法體外培養(yǎng)Thelancet,2003,3:230-240真菌直接涂片的診斷價值肺毛霉菌?。篢helancet,2

微生物培養(yǎng)技術(shù)有意義的真菌培養(yǎng)標本非經(jīng)口痰標本非插管尿標本血液或其他無菌體液、(膽汁、胸腹水、腦脊液）微生物培養(yǎng)技術(shù)有意義的真菌培養(yǎng)標本

微生物培養(yǎng)技術(shù)無菌部位采集的標本(如血,CSF、胸腹水、關(guān)節(jié)液等)中分離的任何酵母都必須鑒定到種，均有診斷意義。同一部位反復(fù)分離出同一菌種也具重要意義。從非無菌部位(糞、痰、咽拭等)分離到的條件致病菌(如白念珠菌)，如直接鏡檢大量菌絲(+)，須結(jié)合臨床認定具致病性。微生物培養(yǎng)技術(shù)無菌部位采集的標本(如血,CSF、胸培養(yǎng)陽性率最高的絲狀真菌曲霉菌屬：185種，約20種被報道過，其中煙曲霉、黃曲霉是常見的致病菌可從痰、支氣管灌洗液、血、腦脊液、角膜刮出物、外耳道、鼻竇、腹膜液、玻璃體中分離到煙曲霉黃曲霉培養(yǎng)陽性率最高的絲狀真菌曲霉菌屬：185種，約20種被報道過重要的真菌感染的表現(xiàn)表現(xiàn)念珠菌曲霉菌發(fā)熱＋＋＋＋＋＋＋＋多發(fā)性關(guān)節(jié)炎＋＋－血脲素氮＋＋－皮膚損害＋＋－肝損害＋＋罕見竇道－＋＋呼吸系統(tǒng)－＋＋＋中樞系統(tǒng)稀少＋＋JohnR.Wingard，IDSA，2005重要的真菌感染的表現(xiàn)表現(xiàn)念珠菌曲霉菌發(fā)熱＋＋＋＋＋＋＋＋多發(fā)合理判斷實驗室的結(jié)果在無菌條件下獲取的體液，如檢測出真菌，應(yīng)考慮到有侵入性真菌感染，可作為臨床開始治療真菌的充分依據(jù)。在腹腔中分離到既有細菌又有念珠菌時，只有當抗細菌治療無效時才考慮抗真菌治療。（高?；颊邉t需要給予抗真菌治療）。

合理判斷實驗室的結(jié)果在無菌條件下獲取的體液，如檢測出真菌，合理判斷實驗室的結(jié)果

尿液：未進行過泌尿系統(tǒng)操作，沒有留置過尿管的病人，出現(xiàn)明顯念珠菌尿，提示有血源性的腎感染。

注意：無糖尿病、泌尿生殖系統(tǒng)異?；驔]有腎移植的病人，如導(dǎo)尿管中出現(xiàn)念珠菌尿，但無臨床癥狀，不治療，應(yīng)盡量除去假體材料或?qū)Ч堋：侠砼袛鄬嶒炇业慕Y(jié)果尿液：未進行過泌尿系統(tǒng)操作，沒有留置合理判斷實驗室的結(jié)果白色念珠菌是正常寄植菌，其臨床意義與監(jiān)測部位及集落形成的數(shù)量有關(guān)。糞白色念珠菌計數(shù)>105cfu/g或尿>105cfu/ml為致病性。其他念珠菌、隱球菌、曲霉菌等不屬于正常菌群，一旦陽性并排除污染后即有意義。兩個或兩個以上非相鄰解剖部位的播散性念珠菌感染較菌血癥的危險性和死亡率均高。合理判斷實驗室的結(jié)果白色念珠菌是正常寄植菌，其臨床意義與監(jiān)呼吸道標本分離到真菌有意義嗎?這是困擾臨床醫(yī)生的一個難題。分析該真菌的臨床價值應(yīng)該由臨床醫(yī)生和微生物專家共同完成，應(yīng)結(jié)合病人基礎(chǔ)病進行分析。呼吸道標本分離到真菌有意義嗎?氣道分泌物中分離出假絲酵母菌意義

人類口腔正常定植菌，正常人20％－55％痰中可分離出假絲酵母菌屬

假絲酵母菌肺炎少見

–發(fā)病率大約0.23－4.5％

25例ICU患者的尸體解剖研究：

–10例（40％）假絲酵母菌培養(yǎng)陽性

–只有2例（8％）是真正的假絲酵母菌肺炎用肺泡灌洗液或毛刷作真菌計數(shù),在24例>103cfu/ml無一例是念珠菌感染實驗室報告會增加唑類藥物的應(yīng)用和耐藥性。氣道分泌物中分離出假絲酵母菌意義

人類口腔正常定植菌，正痰和BAL檢查的診斷意義

上氣道念珠菌定植常見，氣道分泌物（痰和BALF）培養(yǎng)陽性不能作為侵襲性感染的證據(jù)。

EORTC/MSG定義：

痰和BALF中絲狀真菌和隱球菌鏡檢和培養(yǎng)陽性作為感染的微生物學(xué)證據(jù)，而念珠菌培養(yǎng)陽性（無論3次還是更多）只是定植。痰和BAL檢查的診斷意義上氣道念珠菌定植常見，氣道分泌鏡檢和培養(yǎng)方法敏感性低血培養(yǎng)：在腫瘤和血液病病人中，50%尸檢證實深部念珠菌感染的病例血培養(yǎng)陰性。培養(yǎng)結(jié)果陽性僅表示存在某種真菌，區(qū)分定植和感染困難

培養(yǎng)時間長

有些標本采集困難鏡檢和培養(yǎng)方法敏感性低血培養(yǎng)：在腫瘤和血液病病人中，5近年來診斷的進展？

胸部CT掃描PulmonaryCTscan非培養(yǎng)微生物檢查技術(shù)Non-culturebased近年來診斷的進展？

胸部CT掃描PulmonaryC非培養(yǎng)診斷的方法簡介真菌細胞壁成分（1-3）-β-D-葡聚糖檢測（G試驗）真菌抗原檢查半乳甘露聚糖（galactomannan)抗原（GM)甘露聚糖(mannan)抗原隱球菌莢膜多糖抗原（乳膠凝集試驗）

真菌特異的代謝產(chǎn)物（D-阿拉伯糖醇）

真菌DNA的檢測非培養(yǎng)診斷的方法簡介真菌細胞壁成分曲霉菌半乳甘露聚（GM）曲霉菌細胞壁上一種多聚糖抗原可以從血清、腦脊液、胸水、BALF檢測到方法：ELISA（BioRad）：敏感性高1ng/mlLatexagglutination：15ng/ml曲霉菌半乳甘露聚（GM）曲霉菌細胞壁上一種多聚糖抗原半乳甘露聚糖檢測診斷

侵襲性曲霉病(GM試驗)Diagnosisofinvasiveaspergillosisusingagalactomannanassay-ameta-analysis.ClinInfectDis,2006;42:1417–27OMarchetti.NewDevelopmentsandChallengesinDiagnosticsofInvasiveFungalInfections.4thTrendsinMedicalMycology.1996-2005年27項研究的Meta分析患者類型樣本量敏感度(95%CI)特異度(95%CI)惡性血液病296070%(62-77%)92%(90-93%)異基因HSCT90382%(70-90%)86%(83-88%)實體器官移植22422%-40%(3-60%)84%(78-88%)半乳甘露聚糖檢測診斷

侵襲性曲霉病(GM試驗)Diagnos支氣管肺泡灌洗液半乳甘露聚糖檢測OMarchetti.

NewDevelopmentsandChallengesinDiagnosticsofInvasiveFungalInfections.4thTrendsinMedicalMycology.Galactomannaninbronchoalveolarlavagefluid-atoolfordiagnosingaspergillosisinICUpatients.AmJRespCritCareMed,2008;177:27-34ICU曲霉病患者診斷的有效工具BALGM閾值0.5敏感度88%特異度87%血GM閾值0.5敏感度42%特異度78%110例ICU患者納入分析，其中中性粒細胞減少患者僅占22%支氣管肺泡灌洗液半乳甘露聚糖檢測OMarchetti.N合適的判定折點：1.0,0.8,0.5?在兒童的應(yīng)用價值？食物中的GM可以被吸收，假陽性？哌拉西林/他唑巴坦治療，假陽性？非血液病患者應(yīng)用不多抗真菌治療對結(jié)果的影響？半乳甘露聚糖(GM)檢測存在的問題合適的判定折點：1.0,0.8,0.5?半乳甘露聚糖(GM酵母菌、絲狀真菌細胞壁成分不僅檢測曲霉菌，還可以檢測念珠菌、鐮刀菌、毛孢子菌、支頂孢屬不能檢測：隱球菌和接合菌美國FDA已批準，歐洲部分國家已注冊敏感性、特異性：90％左右－D－葡聚糖（G試驗）的價值酵母菌、絲狀真菌細胞壁成分－D－葡聚糖（G試驗）的價值美國大多數(shù)研究限于念珠菌菌血癥其他真菌感染（侵襲性曲霉菌?。┑难芯抠Y料少假陽性：血液透析；接受血制品治療（免疫球蛋白）抗生素對結(jié)果的影響？？－D－葡聚糖（G試驗）的價值美國大多數(shù)研究限于念珠菌菌血癥－D－葡聚糖（G試驗）的價值1.Sennetal.1,3-Beta-D-glucanantigenemiaforearlydiagnosisofIFIsinneutropenicpatientswithacuteleukemia.ClinicalInfectiousDiseases2008;46:878–852.Ostrosky-Zeichneretal.Multicenterclinicalevaluationofthe(1-3)beta-D-glucanassayasanaidtodiagnosisofFIs.ClinicalInfectiousDiseases2005;41:654–9OMarchetti.NewDevelopmentsandChallengesinDiagnosticsofInvasiveFungalInfections.4thTrendsinMedicalMycology.Ostrosky-Zeichner等2,6中心Fungitell試劑盒(一次>60ug/ml)Senn等1,單中心WAKO試劑盒(兩次連續(xù)>7pg/ml)真菌病類型主要為念珠菌病(確診+臨床診斷)非粒缺患者n=107念珠菌病+曲霉病(確診+臨床)粒缺患者n=30敏感度89%63%特異度80%96%陽性預(yù)測值87%79%陰性預(yù)測值81%91%1,3-β-D葡聚糖檢測診斷

侵襲性真菌感染(G試驗)1.Sennetal.1,3-Beta-D-glucOstrosky-Zeichneretal.Multicenterclinicalevaluationofthe(1-3)beta-D-glucanassayasanaidtodiagnosisofIFIs.ClinicalInfectiousDiseases2005;41:654–91,3-β-D葡聚糖檢測診斷

侵襲性真菌感染(G試驗)全部念珠菌n=92白念n=36近平滑n=18熱帶n=11光滑n=26克柔n=3敏感度%82.683.372.290.980.8100.0G試驗檢測不同念珠菌屬的敏感度近似（>60pg/ml,近平滑念珠菌稍低）G試驗檢測不同念珠菌屬的敏感度（>60pg/ml）念珠菌n=92曲霉菌n=10隱球菌n=12鐮刀菌n=3接合菌n=3敏感度%82.680.025.0100.00Ostrosky-Zeichneretal.Multi兩種試驗敏感性、特異性相當都可以在早期診斷侵襲性曲霉病，但是－D－葡聚糖可能出現(xiàn)更早兩者結(jié)合，可以互補彌補GM假陰性可能同樣在粒細胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究半乳甘露聚糖(GM)與－D－葡聚糖（G試驗）比較兩種試驗敏感性、特異性相當半乳甘露聚糖(GM)與－D－葡聚PCRPCR技術(shù)用于診斷種特異-PCR非特異PCR雜交Standart"single""nested"PCR-EIA"Real-time"標本全血血漿血清BAL最低檢測范圍4-10cfu/ml25-100fgDNA原位雜交目的基因多拷貝基因PCRPCR技術(shù)用于診斷種特異-PCRStandart"sPCR過篩試驗診斷IA每周監(jiān)測2次—通用引物;確定采用巢式和實時定量;敏感性100%，特異性65%;早于臨床癥狀2天，早于確診9天；動態(tài)觀察持續(xù)陰性可排除。Dr.MaschmeyerG.in2ndTrendsinMedicalMycology,23-26October2005,Berlin,Germany.PCR過篩試驗診斷IA每周監(jiān)測2次—通用引物;Dr.Masc完成全基因序列測定的病原真菌白念珠菌等致病性念珠菌新生隱球菌粗球孢子菌煙曲霉、構(gòu)巢曲霉等數(shù)種曲霉組織胞漿菌卡氏肺孢子菌完成全基因序列測定的病原真菌白念珠菌等致病性念珠菌突破方向?qū)蚪M序列和功能的了解，找出特異處改進目前方法，提高敏感性Real-timePCR多重PCR芯片技術(shù)其它特異抗原突破方向?qū)蚪M序列和功能的了解，找出特異處真菌血清學(xué)抗原及PCR檢測比較

GMGPCR

曲霉菌屬+++

鐮刀霉菌