第八小組電泳

electrophoresis415宿舍

電泳專題1

隨著電泳技術(shù)不斷發(fā)展和更新，其在臨床醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中有著極其廣泛的應(yīng)用價(jià)值，相信隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展必將越來越受到大家的青睞。早期的電泳技術(shù)是由Svedberg教授提出的，1937年，ArneTiselius教授分離出了馬血蛋白，開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新紀(jì)元。此后，各種電泳技術(shù)及儀器相繼問世，使它在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中占重要地位。它主要用于分離各種有機(jī)物和無機(jī)鹽；也可用于分析物質(zhì)純度，還可用于分子量的測定，可用于實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)，甚至于微生物和細(xì)胞的研究。

2一，概念及原理

帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。電泳技術(shù)：依據(jù)分子或顆粒所帶的電荷、形狀和大小等不同，因而在電場介質(zhì)中移動(dòng)的速度不同，從而使其分離的技術(shù)3

二，分類

4補(bǔ)充a等速電泳加有領(lǐng)先離子和終末離子的樣品，電泳后達(dá)到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排列在領(lǐng)先離子與終末離子的區(qū)帶之間。由于沒有加入適當(dāng)?shù)闹С蛛娊赓|(zhì)來載帶電流，所得到的區(qū)帶是相互連接的，且因“自身校正”效應(yīng)，界面是清晰的，這是與區(qū)帶電泳不同之處。

b高效電泳色譜法

是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術(shù)溶為一體，在從凝膠中洗脫樣品時(shí)，連續(xù)的洗脫液流載著分離好的成分，通過一個(gè)連機(jī)檢測器，將結(jié)果顯示并打印記錄。具有凝膠電泳固有的高分辨率，生物相容性的優(yōu)點(diǎn)，又可方便地連續(xù)洗脫樣品。C毛細(xì)管電泳即微柱膠電泳，是將毛細(xì)管浸入凝膠混合液中，然后將其撳入代用粘土封閉管底，用一支更細(xì)的毛細(xì)管吸水鋪在凝膠上。聚合后，除去水層并加蛋白質(zhì)溶液于凝膠上，毛細(xì)管的空隙用電極緩沖液注滿，切除粘土部分即可。

5三，影響因素1．電泳介質(zhì)的pH值

溶液的pH值決定帶電物質(zhì)的解離程度，也決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少.對蛋白質(zhì)，氨基酸等類似兩性電解質(zhì)，pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，粒子所帶電荷越多，泳動(dòng)速度越快，反之越慢。2.緩沖液的離子強(qiáng)度帶電顆粒的遷移率與離子強(qiáng)度的平方根成反比。低離子強(qiáng)度時(shí)，遷移率快，但離子強(qiáng)度過低,緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定.反之，但電泳譜帶要比低離子強(qiáng)度時(shí)細(xì)窄。3.電場強(qiáng)度

電場強(qiáng)度對電泳速度起著正比作用，一種是高壓電泳,電壓在500～1000V或更高.時(shí)間短,適于低分子化合物的分離，而常壓(100~500V)電泳，產(chǎn)熱量小，室溫在10～25℃，標(biāo)本不被破壞，無需冷卻裝置。4.電滲現(xiàn)象

在電場中,液體對于一個(gè)固體的相對移動(dòng)稱為電滲.

帶電粒子的移動(dòng)距離也受電滲影響；如電泳方向與電滲相反，則實(shí)際電泳的距離等于電泳距離加上電滲的距離.6核酸電泳

方法應(yīng)用DNA測序（變性PAGE）基因組分析DNA分離（非變性瓊脂糖凝膠電泳）DNA片斷或PCR產(chǎn)物分離DNA脈沖場分離(非變性瓊脂糖凝膠電泳)大分子染色體DNA分離7

A瓊脂糖凝膠電泳

⑴設(shè)備與試劑：水平型可制低濃度凝膠，且制膠與加樣都較方便，故應(yīng)用較廣泛。（2）制膠：用緩沖液配制瓊脂糖凝膠溶液，快速地徹底融化，冷至55℃時(shí)加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5μg/ml，然后將其注入玻璃模子中，厚度依樣品濃度而定。注膠時(shí)，梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脫凝固后，取出梳子，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒在緩沖液下1mm處。⑶樣品制備與加樣：溶解于TBE或THE內(nèi)的樣品應(yīng)含指示染料（溴酚藍(lán)或桔黃橙），也可使用2.5％FicoⅡ增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣5-10μl⑷電泳：一般電壓為5-15V/cm。對大分子可用電壓5V/cm。最好在低溫條件下進(jìn)行。根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳.

染色：將凝膠浸入含有EB(0.5ug/ml)的電泳液中，室溫下30-45min。染色完畢后通常不需要脫色。在檢測小量DNA(<10ng)時(shí)，需要脫色。8⑸樣品回收：電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進(jìn)行回收，如電泳洗脫法等，但各種法都僅僅有利于小分子量DNA片段（＜1kb）的回收，隨著DNA分子量的增大，回收量顯著下降。（6）影響因素凝膠。電泳液。電壓、檢測手段，電泳時(shí)間遷移率與其分子量的常用對數(shù)成反比；分子構(gòu)型也對遷移率有影響。（7)用途適用于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化，常用于檢測和分離同工酶及其亞型，大分子核酸等。判斷擴(kuò)增片斷的大小?；厥諗U(kuò)增片斷。用于轉(zhuǎn)印進(jìn)行Southern印跡9B脈沖電泳凝膠電泳(PFGE)

10蛋白質(zhì)電泳11A

紙電泳1)紙電泳就是把樣品以帶狀加在濾紙內(nèi)來檢測其移動(dòng)和分離的方法。常用以分離性質(zhì)相似的物質(zhì)，如各種氨基酸及稀土元素的分離等。2)儀器裝置可分為低壓電泳和高壓電泳兩類。3)操作（1）取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干備用?？砂葱枰眉簦⒃诰嚅L度方向一端5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm處做一記號備點(diǎn)樣用。

(2)點(diǎn)樣有濕點(diǎn)法和干點(diǎn)法。(4)電泳于電泳槽中加入適量枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0),浸沒鉑電極，接通電泳儀穩(wěn)壓電源擋,調(diào)整電壓梯度為18～20V/cm，電泳約1小時(shí)45分鐘，取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點(diǎn)的位置。

(5)含量測定

剪下樣品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)位置面積相近的空白濾紙，剪成細(xì)條，分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時(shí)，用3號垂熔玻璃漏斗濾過，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定測定吸收度，并按吸收系數(shù)計(jì)算含量。12B聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SDS-PAGE):

定義及原理

蛋白質(zhì)電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關(guān)。SDS是陰離子去污劑，使氫鍵、疏水鍵打開，巰基乙醇使P二硫鍵還原，并結(jié)合成P-SDS，所帶的相同密度負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。操作要點(diǎn)1凝膠制備：丙稀酰胺（單體）＋N,N-甲叉雙丙稀酰胺→（催化劑）→聚合催化劑：過硫酸銨＋四甲基乙二胺（TEMED）

AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；交聯(lián)劑；能在線型分子間起架橋作用從而使多個(gè)線型分子相互鍵合交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。常用①過氧化二異丙苯(DCP）②過氧化苯甲酰(BPO)③(DTBP）制膠緩沖液：濃縮膠是大孔膠，緩沖液為pH6.7。有堆積作用，凝膠濃度較小，把較稀樣品加在濃縮膠上，可使其被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。分離膠是AP催化聚合成的小孔膠，緩沖液為pH8.9Tris-HCl。

2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。

13

2樣品處理及加樣上樣緩沖液是Tris-Hcl，DTT，SDS，溴酚藍(lán)和甘油。3電泳（電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液）開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)一起向正極移動(dòng)，電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成穩(wěn)定的界面，使蛋白聚在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。它們以相等的遷移速度從濃縮膠進(jìn)入分離膠后，分子篩作用使其按各自分子量的大小而被分離。4染色與固定5脫色與

分析應(yīng)用；

測定蛋白質(zhì)分子比較成功；用于蛋白質(zhì)定量；用做蛋白質(zhì)純度的鑒定；分離蛋白質(zhì)和寡糖核苷酸

測定樣品P含量：掃描定量（比色）14

C等電聚焦（IEF）

⒈基本原理

電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成一個(gè)由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。P進(jìn)入時(shí)，不同的P移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的P得以分離。2.操作

1）穩(wěn)定的pH梯度的形成：

一種是人工pH梯度.不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。在水平板或電泳管正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，電泳前，各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。

2）兩性電解質(zhì)載體（由多乙烯多胺與丙烯酸制備）

3）支持pH梯度的介質(zhì)密度梯度溶液（用于自由電泳）凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠）4）聚焦電泳5）檢測3.特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測定P或多肽的等電點(diǎn)。特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。缺點(diǎn)：需無鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的P。

15D雙向電泳

IEF/SDS1，第一向IEF等電聚焦電泳（管柱）

加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40，使蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)的不同分開，還應(yīng)有二硫蘇糖醇以促使蛋白質(zhì)變性和肽鏈?zhǔn)嬲?.第二向SDS電泳

（平板）

將圓柱形凝膠在SDS所應(yīng)用的樣品處理液中振蕩平衡，然后包埋在凝膠板上端，即可應(yīng)用

可結(jié)合質(zhì)譜對細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究，可用于分析環(huán)境變化時(shí)細(xì)胞增殖、分化等過程中的基因表達(dá)產(chǎn)物。

最大優(yōu)勢在于它可對一系列復(fù)雜的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，其斑點(diǎn)的矢量圖亦被經(jīng)常使用。如翻譯后的修飾和加工的變化與疾病的發(fā)生相關(guān)，若一個(gè)蛋白有多個(gè)矢量，表明該蛋白可能有多個(gè)翻譯