谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定試劑盒說明書

第第3頁，共3頁貨號：MS1111 規(guī)格：100管/96樣谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書微量法注意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。測定意義：GRGR被TrxR取代）GR催化NADPH還原GSSG生成GSHGSH/GSSGGRGR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。測定原理：GRNADPH還原GSSG再生GSHNADPH脫氫生成NADP+NADPH在340nm相反NADP+在該波長無吸收峰；通過測定340nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計(jì)算GR活性。自備儀器和用品：低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水試劑組成和配置：試劑一：液體×1，4℃保存。試劑二：粉劑×1，4℃保存。臨用前加入2mL試劑三：液體×1，4℃保存。粗酶液提取：組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量個(gè)）：試劑一體積500~1000：1的比例（5001mL試劑一（功率300w37然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。血清等液體：直接測定。操作步驟：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到340nm，蒸餾水調(diào)零。試劑一置于25℃（普通物質(zhì)）或者37℃（哺乳動物）中預(yù)熱30min?？瞻坠埽喝∥⒘渴⒈壬蠡?6孔板，加入170μL試劑一，20μL試劑二，10μL于340nm10s和190s吸光度，記為A空1和A空2，△A空白管=A空1﹣A空2。測定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入150μL試劑一，20μL試劑二，20μL上清液，10μL試劑三，于340nm測定10s和190s吸光度，記為A測1和A測2，△A測定管=A測1﹣A測2注意：空白管只需要測定一次。計(jì)算公式：(1).按蛋白濃度計(jì)算1nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/mgprot)=[(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T=536×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr(2).按樣本質(zhì)量計(jì)算pH8.01nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/g)=△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷(W×VV樣總)÷T=536×(△A測定管-△A空白管)÷W(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GR(nmol/min/104cell)=[(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=536×(△A測定管-△A（4）按液體體積計(jì)算1nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/mL)=[(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T=536×(△A測定管-△A空白管)ε：NADPH6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W：樣品質(zhì)量；V1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min。使用96孔板測定的計(jì)算公式如下按蛋白濃度計(jì)算1nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/mgprot)=[(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T=1072×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr按樣本質(zhì)量計(jì)算pH8.01nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/g)=△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷(W×VV樣總)÷T=1072×(△A測定管-△A空白管)÷W(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/104cell)=[(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=1072×(△A測定管-△A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/mL)=[(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T=1072×(△A測定管-△A空白管)ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W=2×10-2V1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min。注意事項(xiàng)：樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；試劑二須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于