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第第3頁(yè),共3頁(yè)貨號(hào):MS1111 規(guī)格:100管/96樣谷胱甘肽還原酶(GR)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)微量法注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。測(cè)定意義:GRGR被TrxR取代)GR催化NADPH還原GSSG生成GSHGSH/GSSGGRGR還參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)途徑。測(cè)定原理:GRNADPH還原GSSG再生GSHNADPH脫氫生成NADP+NADPH在340nm相反NADP+在該波長(zhǎng)無(wú)吸收峰;通過(guò)測(cè)定340nm吸光度下降速率來(lái)測(cè)定NADPH脫氫速率,從而計(jì)算GR活性。自備儀器和用品:低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水試劑組成和配置:試劑一:液體×1,4℃保存。試劑二:粉劑×1,4℃保存。臨用前加入2mL試劑三:液體×1,4℃保存。粗酶液提?。航M織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心15min,取上清,置冰上待測(cè)。細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量個(gè)):試劑一體積500~1000:1的比例(5001mL試劑一(功率300w37然后8000g,4℃,離心15min,取上清置于冰上待測(cè)。血清等液體:直接測(cè)定。操作步驟:分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm,蒸餾水調(diào)零。試劑一置于25℃(普通物質(zhì))或者37℃(哺乳動(dòng)物)中預(yù)熱30min??瞻坠埽喝∥⒘渴⒈壬蠡?6孔板,加入170μL試劑一,20μL試劑二,10μL于340nm10s和190s吸光度,記為A空1和A空2,△A空白管=A空1﹣A空2。測(cè)定管:取微量石英比色皿或96孔板,加入150μL試劑一,20μL試劑二,20μL上清液,10μL試劑三,于340nm測(cè)定10s和190s吸光度,記為A測(cè)1和A測(cè)2,△A測(cè)定管=A測(cè)1﹣A測(cè)2注意:空白管只需要測(cè)定一次。計(jì)算公式:(1).按蛋白濃度計(jì)算1nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/mgprot)=[(△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T=536×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr(2).按樣本質(zhì)量計(jì)算pH8.01nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/g)=△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷(W×VV樣總)÷T=536×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GR(nmol/min/104cell)=[(△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=536×(△A測(cè)定管-△A(4)按液體體積計(jì)算1nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/mL)=[(△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T=536×(△A測(cè)定管-△A空白管)ε:NADPH6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1L;106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);W:樣品質(zhì)量;V1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,3min。使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下按蛋白濃度計(jì)算1nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/mgprot)=[(△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T=1072×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr按樣本質(zhì)量計(jì)算pH8.01nmolNADPH氧化為個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/g)=△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷(W×VV樣總)÷T=1072×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/104cell)=[(△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=1072×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量(4)按液體體積計(jì)算1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GR酶活(nmol/min/mL)=[(△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T=1072×(△A測(cè)定管-△A空白管)ε:NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4L;106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);W=2×10-2V1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,3min。注意事項(xiàng):樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力,勻漿液避免反復(fù)凍融;試劑二須現(xiàn)配現(xiàn)用,配制完后,置于
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