第九章中藥制劑分析新方法新技術(shù)0pt

第六章中藥制劑檢驗新技術(shù)

目前，各種先進的分析技術(shù)和方法越來越多地用于中藥及其制劑，從而大大提高了藥品檢驗工作的質(zhì)量和水平。例如，指紋圖譜技術(shù)（FP）、毛細管電泳法（CE）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICPMS）、原子吸收分光光度法（AAS）以及各種色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等。其中有些已被《中國藥典》收載，成為法定的檢驗方法。本章將重點介紹指毛細管電泳法。

第一節(jié)毛細管電泳法

（一）原理毛細管電泳（CE）亦稱為高效毛細管電泳法（HPCE），是20

世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一類高效快速的分離分析方法。該法系以彈性毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分的淌度（單位電場強度下的遷移速度）和分配行為的差異而實現(xiàn)分離，因此可將其視為經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。CE分離原理圖示（二）特點

高效、低耗、快速、廣譜

與HPLC比較

1.柱效更高，理論板數(shù)可達105~106m-1，這主要是由于該法無固定相，不存在傳質(zhì)差異，整個流體就像塞子似的以均速向前流動。2.分析速度更快，幾十秒至十幾分鐘內(nèi)即可完成一個試樣的分析。3.溶劑和樣品消耗極少，樣品用量僅為納升（nl）級。不需高壓泵輸液，毛細管價格低廉，因此工作成本更低。4.通過改變操作模式和緩沖溶液的成分，該法有很大的選擇性，可對各種成分進行有效的分離。例如，中性有機分子、無機離子、蛋白質(zhì)等高分子化合物，甚至整個細胞或病毒。HPLCCE（三）分離模式（共6種）

1.毛細管區(qū)帶電泳（CZE）

CZE又稱為自由溶液區(qū)帶電泳，系毛細管電泳中最基本、應(yīng)用最廣的一種操作模式，即將分析溶液引入毛細管進樣一端，施加直流電壓后，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細管出口端，按陽離子、中性分子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。但中性組分彼此不能分離，因均隨電滲流（EOF）一起遷移。出峰時間稱為遷移時間（tm），相當(dāng)于高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）中的保留時間。CZE較適合帶電溶質(zhì)的分離，由于中性物質(zhì)均系靠電滲流遷移，不存在遷移速度的差異，故不能實現(xiàn)分離。2.膠束電動毛細管色譜（MEKC或MECC）該法系以膠束為假固定相的一種電動色譜。當(dāng)操作緩沖液加入大于其臨界膠束濃度的離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）或十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、膽酸等，這時表面活性劑就聚集形成膠束（假固定相），其親水端朝外，憎水非極性核朝內(nèi)，溶質(zhì)則在水和膠束兩相間分配，各溶質(zhì)因分配系數(shù)存在差別而被分離。對于常用的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS），進樣后極強親水性組分不能進入SDS膠束，隨操作緩沖液流過檢測器（容量因子k’=0）；極強憎水性組分則進入SDS膠束的核中不再回到水相，最后到達檢測器(k’=∞)。其分離原理見下圖。

該法適合中性物質(zhì)的分離。因不同的溶質(zhì)在膠束中的分配系數(shù)不同，其遷移速度存在差異而實現(xiàn)分離。MECC彌補了CZE不能分離中性物質(zhì)的不足，進一步拓寬了毛細管電泳的應(yīng)用范圍，鑒于中藥多數(shù)為離子型和中性物質(zhì)的混合體，因此MECC更適合于中藥分析。3.毛細管凝膠電泳（CGE）

該法在毛細管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)生成凝膠，該方法主要用于分析蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子。另外還可利用聚合物溶液，如葡聚糖等的篩分作用進行分析，稱為毛細管無膠篩分。有時將它們統(tǒng)稱為毛細管篩分電泳，下分為凝膠電泳和無膠篩分兩類。4.毛細管等速電泳（CITP）

該法采用前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細管中充入前導(dǎo)電解質(zhì)后，進樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移到各個狹窄的區(qū)帶，然后依次通過檢測器。5.毛細管等電聚焦電泳（CIEF）

將毛細管內(nèi)壁涂覆聚合物減小電滲流，再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進樣，兩個電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后，毛細管中的操作電解質(zhì)溶液逐漸形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛細管中遷移至各自等電點（PI）時變?yōu)橹行?，形成聚焦的區(qū)帶，而后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值的辦法使溶質(zhì)通過檢測器。

6.毛細管電色譜（CEC）該法是在毛細管電泳技術(shù)不斷發(fā)展和液相色譜理論日益完善的基礎(chǔ)上逐漸興起的。它是將細粒徑固定相填充到毛細管中或在毛細管內(nèi)壁涂覆固定相以電滲流驅(qū)動操作緩沖液（有時再加輔助壓力）進行分離的，包含了色譜和電泳兩種機制，其中以色譜為主，但對荷電溶質(zhì)兼有電泳作用。該法克服了CE選擇性差和分離中性物質(zhì)困難的缺點，同時提高了液相色譜的分離效率，形成其獨特的高效、微量、快捷的特點，開辟了高效微柱分離技術(shù)的新途徑。二、儀器設(shè)備

（一）毛細管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)（見下圖）

1.電極槽和進樣系統(tǒng)

2.清洗系統(tǒng)

3.毛細管

4.檢測器

5.鉑電極

6.電極槽

7.恒溫系統(tǒng)

8.記錄和數(shù)據(jù)處理（二）主要部件及其性能

1.毛細管毛細管為彈性石英毛細管。內(nèi)徑50μm和75μm兩種使用較多，內(nèi)徑細的分離效果較好，但柱上檢測因光程較短，檢測限比內(nèi)徑粗的要差。毛細管長度稱為總長度，根據(jù)分離度的要求，可選用20～100cm長度，進樣端至檢測器間的長度稱為有效長度。毛細管常盤放在管架上，在一定溫度下操作，以控制焦耳熱，操作緩沖液的黏度和電導(dǎo)度，對測定的重復(fù)性很重要。

2.直流高壓電源

一般采用0~30kV（或相近）可調(diào)節(jié)直流電源，可供應(yīng)約300μA電流，具有穩(wěn)壓和穩(wěn)流兩種方式可供選擇。

3.電極和電極槽

兩個電極槽里放入操作緩沖液，分別插入毛細管的進口端與出口端以及鉑電極，鉑電極接至直流高壓電源，正負(fù)極可切換。多種型號的儀器將樣品瓶同時用做電極槽。

4.沖洗進樣系統(tǒng)

每次進樣之前毛細管要用不同的溶液沖洗，選用自動沖洗進樣儀器較為方便。進樣方法有壓力進樣、負(fù)壓進樣、虹吸進樣和電動進樣等。進樣時通過控制壓力、電壓或時間來控制進樣量。

5.檢測器

紫外檢測器，熒光檢測器，電化學(xué)檢測器，質(zhì)譜儀等均可作為CE的檢測器。其中紫外檢測器應(yīng)用最廣，它是將毛細管接近出口端的外層聚合物剝?nèi)ゼs2mm一段，使石英管壁裸露，毛細管兩側(cè)各放置一個石英聚光球，使光源聚焦在毛細管上，透過毛細管到達光電池對溶質(zhì)進行檢測。1.檢測窗口2.毛細管3.基座4.調(diào)焦機構(gòu)5.圓形狹縫6.狹縫7.球透鏡photo沖洗裝置樣品瓶毛細管UVD電極槽電極槽6.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與一般色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本相同。三、基本操作

（一）準(zhǔn)備工作

1.按照儀器操作手冊開機，預(yù)熱，輸入各項參數(shù)，如毛細管溫度、操作電壓、檢測波長、沖洗程序等。

2.

按照各品種項下的規(guī)定配制操作緩沖液。操作緩沖液須過濾和脫氣。沖洗液、緩沖液等放置于樣品瓶中，依次放入進樣器。操作緩沖液的種類、pH值和濃度，以及添加劑（用以增加溶質(zhì)的溶解度和/或控制溶質(zhì)的解離度，手性拆分等）的選定對測定結(jié)果的影響很大，應(yīng)根據(jù)初試的結(jié)進行果調(diào)整、優(yōu)化。四、系統(tǒng)適用性試驗

目的在于考察所配置的毛細管分析系統(tǒng)和設(shè)定的參數(shù)是否適用。測試項目和方法與高效液相色譜法或氣相色譜法相同，相關(guān)的計算式和要求也相同。如重復(fù)性（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD）、容量因子（k’）、毛細管理論數(shù)（n）、分離度（R）、拖尾因子（T）、線性范圍、最低檢測限（LOD）等，最低定量限（LOQ）等，可參照測定。具體指標(biāo)應(yīng)符合各品種項下的規(guī)定。特別是進樣精度，不同荷電溶質(zhì)遷移速度的差異對分析精密度的影響。（二）毛細管的處理毛細管處理的好壞對測定結(jié)果影響很大。未涂層新毛細管要用較濃堿液在較高溫度（例如1mol/L氫氧化鈉液在60℃）沖洗，使毛細管內(nèi)壁生成硅羥基，再依次0.1mol/L氫氧化鈉，水，操作緩沖液沖洗分?jǐn)?shù)分鐘。兩次進樣中間可僅用緩沖液沖洗，但若發(fā)現(xiàn)分離性能改變，則開始用0.1mol/L氫氧化鈉沖洗，甚至要用濃氫氧化鈉液升溫沖洗。凝膠毛細管，涂層毛細管，填充毛細管的沖洗則應(yīng)按照所附說明操作。沖洗時將盛溶液樣品瓶依次置于進樣器，設(shè)定順序和時間進行。（三）進樣測試

將待測樣品溶液瓶置于進樣器中，設(shè)定操作參數(shù)，如進樣壓力（電動進樣電壓）、進樣時間、正極端或負(fù)極端進樣、操作電壓或電流、檢測器參數(shù)等，開始分析。根據(jù)初試的電泳譜圖調(diào)整儀器和操作緩沖液以獲得優(yōu)化結(jié)果。而后用優(yōu)化條件正式分析。（四）數(shù)據(jù)處理有關(guān)CE的計算方法、公式等可參照《中國藥典》高效液相色譜法的有關(guān)規(guī)定，將保留時間（tR）改為遷移時間(tm)即可。（五）結(jié)束工作

分析完成后用水沖洗毛細管，注意將毛細管兩端浸入水中保存，如果長久不用應(yīng)將毛細管用氮吹干，最后關(guān)機。（六）注意事項由于進樣方法的限制，目前毛細管電泳的精密度比用定量閥進樣的高效液相色譜法差，故定量測定以采用內(nèi)標(biāo)法為宜。用加壓或減壓法進樣時，樣品溶液黏度會影響進樣體積，應(yīng)注意保持試樣溶液和對照品溶液黏度一致；用電動法進樣時，被測組分因電荷不同的電歧視現(xiàn)象和溶液離子強度會影響待測組分的遷移量，也要注意其影響。五、應(yīng)用實例

山茱萸及六味地黃丸中沒食子酸的含量測定

沒食子酸為中藥山茱萸的有效成分，山茱萸為六味地黃丸藥味之一。沒食子酸在堿水中可電離成陰離子，故本法采用毛細管區(qū)帶電泳法（CZE），肉桂酸為內(nèi)標(biāo)物，測定二者中沒食子酸的含量，以控制其質(zhì)量。沒食子酸肉桂酸（一）儀器與試劑

Unimicro毛細管電泳儀；毛細管60cm（有效長度45cm）×75μm；沒食子酸對照品，肉桂酸對照品，95%乙醇，硼砂（分析純），去離子水，市售山茱萸，六味地黃丸（水蜜丸（二）實驗條件

操作緩沖溶液為20mmol/L硼砂溶液，檢測波長271nm，重力進樣（10cm×5s），工作電壓20kV，電泳溫度20℃，每次運行前依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、去離子水、操作緩沖溶液沖洗3min。（三）測試溶液的制備

對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對照品19.5mg于25ml量瓶中，用95%乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液；稱取肉桂酸對照品9.6mg，用95%乙醇溶解并稀釋至25ml，作為內(nèi)標(biāo)溶液。山茱萸供試品溶液的制備將山茱萸藥材剪碎，稱取5g，加95%乙醇50ml，浸泡12小時，加熱回流提取2小時，過濾，濾渣重復(fù)提取2次，合并提取液，減壓濃縮至10ml.

移至50ml量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml并加入內(nèi)標(biāo)溶液1ml，95%乙醇稀釋定容至5ml，搖勻，即得。六味地黃丸供試品溶液的制備取六味地黃丸粉碎后，稱取5g，提取方法同山茱萸藥材，減壓濃至10ml，以下操作同山茱萸供試品溶液的制備，即得。（四）系統(tǒng)適用性試驗

在山茱萸的測定中，沒食子酸的理論板數(shù)n=179820，在六味地黃丸的測定中，沒食子酸的理論板數(shù)n=167388，沒食子酸與周圍組分分離良好，無干擾組分存在。下圖為山茱萸、六味地黃丸樣品和對照品的電泳圖譜。

山茱萸（A）、六味地黃丸（B）和對照品（C）的電泳圖譜（1.肉桂酸；2.沒食子酸）（五）方法學(xué)考察線性范圍精密量取沒食子酸對照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml于5ml量瓶中，各加入肉桂酸內(nèi)標(biāo)液1ml，95%乙醇定容至刻度