酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在食品安全快速檢測上的應(yīng)用

酶聯(lián)免疫技術(shù)

與食品安全快速檢測姓名:陳超學(xué)號：201423104001目錄ELISA概述ELISA的常用方法ELISA的應(yīng)用一、ELISA概述酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：是在免疫熒光和組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)。主要是利用抗原與抗體的高特異性反應(yīng)，通過合適的載體，使酶標(biāo)抗原或抗體與待測樣品反應(yīng)，形成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，在相應(yīng)的酶底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使之水解成有色物質(zhì)。一定條件下，呈色物質(zhì)與待測物的含量直接相關(guān)，因此可以根據(jù)呈色物質(zhì)顏色的深淺，對待測樣品進(jìn)行定性定量分析?；静襟E（以雙抗體夾心法為例）包被：將Ab包被到酶標(biāo)板上,進(jìn)行洗滌封閉：封閉酶標(biāo)板上的非特異結(jié)合位點(diǎn)加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、陰性及空白對照樣品加入酶標(biāo)板，洗滌加酶標(biāo)抗體：加入酶標(biāo)記的二抗，洗滌顯色：加入底物，在酶作用下發(fā)生顯色反應(yīng)檢測：檢測有色溶液在490nm波長下的OD值結(jié)果分析：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析受檢樣品濃度常用的標(biāo)記酶有：辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、堿性磷酸酯酶等。這一類酶通常滿足以下條件：具有較高的催化專一性和活性與抗原抗體偶聯(lián)后不影響自身酶活性和抗原抗體的免疫活性催化反應(yīng)的信號產(chǎn)物易檢測價(jià)廉易得對人體無害二、ELISA的常用方法夾心法間接法測抗體競爭法雙抗體夾心法測抗原雙抗原夾心法測抗體競爭法測抗原競爭法測抗體（1）雙抗體夾心法A.

將抗體吸附于固相表面;B.

加待檢抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

加酶標(biāo)抗體;D.加底物。底物的降解量與抗原量成正比。

此法常用于檢測抗原（2）間接法A.

將抗原吸附于固相載體表面；B.

加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

加酶標(biāo)二抗；D.加底物。測定底物的降解量與抗體量成正比。

此法常用于測定抗體（3）競爭法測定抗原A.

將抗體吸附在固相載體表面;

同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體；C.加底物。底物降解量與未知抗原量成反比。此法既可用于檢測抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體限量的抗體酶標(biāo)抗原待測抗原酶標(biāo)多于樣品顯色程度深樣品多于酶標(biāo)顯色程度淺顯色程度與待測物含量成反比包被加底物顯色三、ELISA快速檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用實(shí)例

水產(chǎn)品中殘留氯霉素的測定

氯霉素，是一種廣譜抗菌素。氯霉素對骨髓造血機(jī)能有抑制作用，可引起血小板減少性紫癜、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血，腹脹、腹瀉、食欲減退，口腔粘膜充血、疼痛、糜爛、口角炎和舌炎等。另外還可引起視神經(jīng)炎、視力障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎、神經(jīng)性耳聾以及嚴(yán)重失眠。檢測原理：競爭法測抗原即游離氯霉素與氯霉素酶聯(lián)記物競爭氯霉素抗體結(jié)合位點(diǎn)具體方法：酶標(biāo)板包被有針對兔IgG（氯霉素抗體）的羊抗體。加入氯霉素抗體、氯霉素酶聯(lián)記物、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。氯霉素抗體與固定的羊抗體結(jié)合。游離氯霉素與氯霉素酶聯(lián)記物競爭氯霉素抗體結(jié)合位點(diǎn)。沒有結(jié)合的氯霉素酶聯(lián)記物在洗滌步驟中被除去。結(jié)合的氯霉素酶聯(lián)記物將無色的酶底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物，加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)變成黃色。用酶聯(lián)分析儀于波長450nm下進(jìn)行吸光度測定。ELISA是測定水產(chǎn)品中氯霉素含量的一種好方法。由于酶的專一性催化作用，酶標(biāo)板上多份樣品同時(shí)檢測，故操作簡單，靈敏度，精密度較高，是測定水產(chǎn)品中氯霉素含量的一種好方法。目前用于食品安全性檢測的方法有很多，常見的有：ELISA檢測技術(shù)微生物學(xué)方法薄層色譜法氣象色譜法高效液相色譜法PCR技術(shù)核酸探針技術(shù)（1）高靈敏度，可達(dá)到10億萬分之一甚至更低（2）高特異性（3）寬適用范圍，可測定各類食品（4）低檢測費(fèi)用（5）易商品化應(yīng)用前景謝謝！抗原的制備抗原：是指能夠引起機(jī)體特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)，即同時(shí)具有免疫原性和抗原性。半抗原：具有免疫原性的物質(zhì)也必然具有抗原性，不具有免疫原性只有抗原性的物質(zhì)稱為半抗原。半抗原相當(dāng)于一個(gè)抗原決定簇，即只具有抗原性，能與抗體結(jié)合，但不具有免疫原性，不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。一般認(rèn)為，分子量越大，抗原的表面決定簇越多，越有利于免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。農(nóng)藥一般為不含蛋白質(zhì)的小分子化合物，是只具有抗原性的半抗原，在進(jìn)行免疫分析之前，還要對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，使之成為可用的半抗原。典型的半抗原結(jié)構(gòu)中應(yīng)具備適當(dāng)末端活性基團(tuán)，如一NHz、一COOH、一0H、一SH等，可直接與載體偶聯(lián)；與載體連接后應(yīng)保證該特征結(jié)構(gòu)能最大程度地為免疫活性細(xì)胞識別和結(jié)合，以制備出具有預(yù)期選擇性和親合性的抗體；同時(shí)還需相應(yīng)地突出特定農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)或者一類農(nóng)藥中共有的結(jié)構(gòu)特征例。半抗原修飾好后，一般要與合適的載體蛋白以共價(jià)鍵偶聯(lián)，使之具有免疫原性，稱之為人工抗原。如果農(nóng)藥分子上不具有所需的活性基團(tuán)，則需利用化學(xué)方法引入制成半抗原，再與載體偶聯(lián)。常用的載體蛋白有牛血清白蛋白、卵清蛋向、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、人血纖維蛋白、甲狀腺球蛋白、豬血清白蛋白等。常用的偶聯(lián)方法有：混合酸酐法、碳二亞胺法、重氮化法、戊二醛法等?？贵w的制備抗體：是機(jī)體受到抗原刺激后，機(jī)體體液中產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。較為常見的抗體有多克隆抗體和單克隆抗體。多克隆抗體是經(jīng)特定的抗原免疫動物后得到的抗血清抗體，是免疫分析中常用的抗體類型。單克隆抗體：由單個(gè)B細(xì)胞增殖形成的群落產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)相同、功能均一的抗體稱為單克隆抗體。多克隆抗體的特異性、穩(wěn)定性以及抗體效價(jià)都不及單克隆抗體。但是單克隆抗體制備涉及細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞融合，對實(shí)驗(yàn)條件要求較高，不易制備。多克隆抗體實(shí)際也能滿足檢測的需要，因此，目前ELISA的研究以使用多克隆抗體較多?？贵w制備好后，需要對抗體進(jìn)行效價(jià)(又稱滴度)、親和力及交叉反應(yīng)的表征來判斷制備的抗體是否有效。ELISA在毒素檢測中的應(yīng)用真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。有些對人類危害很大，它們同時(shí)具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點(diǎn)。其中產(chǎn)毒最大，致癌力最強(qiáng)的是黃曲霉毒素。至今，幾乎所有重要真菌毒素的ELISA檢測方法均已建立ELISA在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用ELISA已成為許多國際權(quán)威分析機(jī)構(gòu)分析農(nóng)藥殘留的首選方法。迄今為止，應(yīng)用ELISA檢測食品中的殘留農(nóng)藥主要為除草劑、殺蟲劑、和殺菌劑。由于該技術(shù)具有樣本前處理簡單，純化步驟少，大量樣本分析時(shí)間短，適合于做成試劑盒現(xiàn)場篩選等優(yōu)點(diǎn)，使其可在蔬菜產(chǎn)區(qū)，批發(fā)市場和海關(guān)配備，工商人員可隨身攜帶或建立固定的農(nóng)藥殘留速測點(diǎn)，隨時(shí)把殘留超標(biāo)的蔬菜，水果杜絕在食用之前。ELISA在細(xì)菌污染檢測中的應(yīng)用食品中有害細(xì)菌數(shù)量達(dá)一定數(shù)目，食用后會引起各種疾病。為有效控制其傳播，就必須有快速和可靠的檢測方法。利用ELISA檢測的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。例如對沙門氏菌最低檢測量可達(dá)500CFU/g，僅需22h，比常規(guī)方法縮短了3~4d。此外以ELISA技術(shù)為基礎(chǔ)的全自動沙門氏菌檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)過程的自動化，全程耗時(shí)僅為45min，ELISA在肉類品質(zhì)檢測中的應(yīng)用ELISA在肉類品質(zhì)檢測中的應(yīng)用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測兩方面。ELISA在動物性食品中藥物殘留檢測上的應(yīng)用例如瘦肉精酶聯(lián)免疫檢測法，基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競爭性抑制測定，不僅可作為一個(gè)定性篩選過程，也可以進(jìn)一步進(jìn)行定量測定。檢測靈敏度可達(dá)到0.5×10-9，完全達(dá)到我國農(nóng)業(yè)部目前的1×10-9監(jiān)督檢測標(biāo)準(zhǔn)。酶聯(lián)免疫法作為藥物殘留量的篩選方法具有操作簡單、準(zhǔn)確快速的特點(diǎn)，適用于大量樣品的測定。ELISA在人獸共患疾病病原體檢測上的應(yīng)用例如在禽流感病毒檢測方面，我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用，建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù)，已形成試劑盒生產(chǎn)能力。ELISA在食物中其它成分檢測上的應(yīng)用如：檢測某些特定的轉(zhuǎn)移基因表達(dá)蛋白，以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分；食品中營養(yǎng)素的測定；分析植物中含量很低的雌激素；也可用于檢測食品加工過程中的酶含量的變化等。毒素檢測農(nóng)藥殘留檢測細(xì)菌污染檢測肉類品質(zhì)檢測動物性食品中藥物殘留檢測人獸共患疾病病原體檢測重金屬污染檢測食物中其他成分檢測……三、ELISA快速檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用1、雙抗體夾心法：此法常用于檢測抗原它是利用待測抗原上的兩個(gè)抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)記抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比。抗體A待測抗原酶標(biāo)抗體B包被物加底物顯色2、間接法測定抗體此法常用于測定抗體將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗體量成正比。抗原待測抗體酶標(biāo)二抗包被物加底物顯色3、競爭法此法既可用于檢測抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測的非標(biāo)記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測抗原（抗體）多，