基因制備與克隆策略管理知識(shí)分析

基因制備與克隆策略管理知識(shí)分析

第五章基因工程工具酶TheTooloftheGeneEngineering

教學(xué)目的與要求：1）掌握II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割原理，和部分常用識(shí)別位點(diǎn)。2）掌握常作DNA聚合酶的特性和用途。3）了解DNA連接酶和修飾酶在基因操作中的用途。2第一節(jié)目的基因的制備

3目的基因（TargetGene）：指基因工程中需要進(jìn)行制備、克隆或利用的基因。制備目的基因要根據(jù)需要獲得DNA片段，可能是啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子，或者是編碼某種蛋白完整的序列。目的基因制備方法有直接分離法、基因文庫(kù)篩選法、PCR擴(kuò)增法以及化學(xué)合成法等。一、目的基因的直接分離法1．限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法這是最簡(jiǎn)單的獲取目的基因的方法，主要是從質(zhì)粒、病毒等比較簡(jiǎn)單的DNA分子或基因組中分離目的基因。無(wú)論是已知序列或是尚未測(cè)序的序列都可進(jìn)行分離，只要確定目的基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)，就可用相應(yīng)的酶進(jìn)行切割，獲得目的基因。42.基因分離的物理化學(xué)法其原理是根據(jù)基因的DNA分子兩條鏈GC含量差異較大，理化性質(zhì)、包括浮力密度和解鏈溫度明顯不同所采用相應(yīng)的方法進(jìn)行分離。（1）密度梯度離心法將DNA切割成適當(dāng)片段，富含GC的雙鏈DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速離心技術(shù)，可將DNA片段按不同密度大小分開。（2）單鏈酶解法基因GC含量高（三個(gè)氫鍵），Tm值高，熱穩(wěn)定性高，可通過(guò)控制解鏈溫度使富含A=T區(qū)變性解鏈，GC區(qū)維持雙鏈狀態(tài)，再利用單鏈核酸酶S1酶切單鏈部分，獲得富含GC的基因片段。（3）分子雜交法利用DNA單鏈易與互補(bǔ)鏈形成雙鏈的原理，將已知基因DNA與目的生物的DNA進(jìn)行復(fù)性，再用單鏈核酸酶S1酶切除單鏈，留下的雙鏈即為目的基因序列53.雙抗體免疫法分離編碼蛋白基因

基因翻譯過(guò)程中，核糖體沿mRNA進(jìn)行多肽鏈合成時(shí)形成多聚核糖核蛋白體。利用多肽鏈制備的抗體及二抗，與多聚核糖核蛋白體一起溫育，目的基因的多聚核糖核蛋白體將通過(guò)抗原抗體反應(yīng)與相應(yīng)抗體形成復(fù)合物，利用不連續(xù)蔗糖梯度離心將此復(fù)合物分離出來(lái)，再通過(guò)酚/仿抽提法出去蛋白質(zhì)部分，過(guò)oligo-dT柱層析，即可分離出特定蛋白編碼的mRNA，反轉(zhuǎn)錄即可得到cDNA。目前，可用金黃色葡萄球菌中分離的proteinA代替二抗，再用proteinA-Sepharose4B作親和層析，分離出特定的多聚核糖體（代替密度梯度離心）。

64．利用酶促反轉(zhuǎn)錄直接從特定mRNA分離基因此法是在目的基因的mRNA占細(xì)胞中總mRNA量很大時(shí)采用，直接用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，與載體重組后導(dǎo)入受體菌擴(kuò)增，獲得目的基因的cDNA克隆。如哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中珠蛋白mRNA占總mRNA的90%以上，用此法克隆了該基因。75．構(gòu)建基因文庫(kù)分離目的基因基因文庫(kù)分基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。基因文庫(kù)可用質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體和酵母人工染色體（YAC）載體進(jìn)行構(gòu)建。從基因組文庫(kù)可以分離獲得基因編碼序列、調(diào)控序列、啟動(dòng)子、終止子、核糖體識(shí)別mRNA序列、ARS、端粒序列、間隔序列等，可用于基因結(jié)構(gòu)分析、基因表達(dá)和調(diào)控研究等。cDNA文庫(kù)來(lái)自于模板mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄及加工后mRNA產(chǎn)物所攜帶的信息，所以從cDNA文庫(kù)可以分離到基因的編碼序列。8篩選基因文庫(kù)的方法：①已知基因序列，可以人工合成核酸探針，通過(guò)核酸雜交，從基因文庫(kù)中篩選出含目的基因的克隆。②已分離純化某蛋白，并知其氨基酸序列，根據(jù)氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作為探針，篩選基因文庫(kù)。③已純化某蛋白，未能測(cè)出其氨基酸序列，可以該蛋白制備抗體，從cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選出含該蛋白編碼基因的克隆。④對(duì)編碼產(chǎn)物未知的基因，采用特殊分離方法如差別顯示技術(shù)、差減雜交法、遺傳互補(bǔ)法等。9遺傳互補(bǔ)法（功能互補(bǔ)法）原理：當(dāng)把一外源DNA片段引入一受體細(xì)胞后，如果受體細(xì)胞獲得某種新的性狀，那么此片段上攜帶著決定新性狀的遺傳基因。必備條件：外源基因不僅能在受體細(xì)胞表達(dá)，而且必須具備生物學(xué)活性。營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體細(xì)胞+外源DNA→轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在合成培養(yǎng)基上→原養(yǎng)型細(xì)胞生長(zhǎng)受體細(xì)胞（無(wú)某種表型）+外源DNA→轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在特殊培養(yǎng)基上→具有新性狀細(xì)胞雖然有些受體細(xì)胞也能產(chǎn)生某種酶活性，但當(dāng)轉(zhuǎn)入目的基因后，該細(xì)胞可過(guò)量產(chǎn)生此酶活性，這亦可用于基因篩選。如釀酒酵母的MFα基因就是如此篩選到的。實(shí)例：基因組文庫(kù)DNA→轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞（leu2,Leu-）→轉(zhuǎn)化細(xì)胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因組文庫(kù)DNA→轉(zhuǎn)化E.coli（無(wú)纖維素酶活性）→轉(zhuǎn)化細(xì)胞可在纖維素平板上形成水解圈→纖維素酶基因10核酸雜交法（同源序列克隆法）：（1)原理利用核酸探針與待分離DNA的同源序列可進(jìn)行雜交的特點(diǎn)分離目的基因。（2)核酸探針?lè)N類①DNA探針:分離自某一種生物。②寡核苷酸探針:根據(jù)目的基因編碼蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列推測(cè)，人工化學(xué)合成。如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN對(duì)應(yīng)mRNAN：ACGT/UCAN-AAP-GTP-CTP-CG探針序列Q：CT/UP：AG32種14聚體的混合物，其中必有一種與待測(cè)DNA完全互補(bǔ)。cDNA探針:利用特異性mRNA反轉(zhuǎn)錄而成，亦可用不同mRNA混合物反轉(zhuǎn)錄而成。RNA探針:由T3或T7啟動(dòng)子和相應(yīng)聚合酶轉(zhuǎn)錄其下游基因片段而得。11分離步驟：基因文庫(kù)→制備DNA樣品膜→與標(biāo)記探針雜交→雜交斑點(diǎn)（陽(yáng)性克隆）→分離重組DNA分子→作斑點(diǎn)和Southern雜交以確認(rèn)雜交結(jié)果→DNA進(jìn)一步證實(shí)和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)比較；分離插入片段進(jìn)行基因表達(dá)，用免疫方法或其他方法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。6．特異性DNA片段(基因)的PCR擴(kuò)增124．目的基因的化學(xué)合成法（1）核酸片段化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法和亞磷酸三酯法，反應(yīng)體系有液相和固相。目前常用的方法是固相亞磷酸三酯法。第一個(gè)核苷酸的3`端通過(guò)3`羥基與惰性固相載體上的間隔臂形成酯健，寡核苷酸按3`-5`方向進(jìn)行化學(xué)合成，正常終產(chǎn)物是3`、5`端均帶有羥基的寡聚核苷酸。合成原料：經(jīng)化學(xué)修飾的核苷—亞磷酰胺。有兩種類型：①甲基化亞磷酰胺；②?-氰乙基-亞磷酰胺。合成時(shí)要對(duì)羥基、磷酸、氨基進(jìn)行保護(hù)，合成結(jié)束后，去掉所有保護(hù)基團(tuán)。固相載體：是對(duì)DNA合成試劑惰性的物質(zhì)，目前采用可控孔徑的玻璃沙（CPG）,其表面的硅氧烷鍵可與A、G、C、T核苷的3`-羥基以酯鍵連接，該鍵可用29%濃氨水打斷。13反應(yīng)分四步：1）二甲氧三苯甲基（DMT，羥基保護(hù)基團(tuán)）的脫除用三氯乙酸（TCA）或二氯乙酸（DCA）處理，脫去連在固相載體上的核苷酸或寡核苷酸5`羥基的DMT保護(hù)基團(tuán)。2）偶聯(lián)反應(yīng)（縮合反應(yīng)，加成反應(yīng)）由溶于無(wú)水乙腈中的四唑催化，使亞磷酰胺單體的3`磷酸基團(tuán)與固相載體上的5`羥基發(fā)生反應(yīng)，形成亞磷酸三酯鍵。3）封閉反應(yīng)加成反應(yīng)剩下的亞磷酰胺，以N-甲基瞇唑催化，用乙酸酐使羥基乙酰化，封閉其羥基，防止在下一循環(huán)中發(fā)生加成反應(yīng)。4）氧化反應(yīng)在堿性條件下，以碘使加成反應(yīng)形成的3`，5`亞磷酸三酯鍵氧化為穩(wěn)定的5價(jià)磷酸三酯。上述每循環(huán)一次，增加一個(gè)核苷酸，需7~9min。每一步反應(yīng)完成都以乙腈清洗，氬氣吹干，保證無(wú)水環(huán)境。合成反應(yīng)結(jié)束后，除去保護(hù)基團(tuán)，29%濃氨水處理使寡聚核苷酸從載體上釋放出來(lái)，乙醇或異丙醇沉淀、回收DNA。用RNA亞磷酸胺單體和聚苯乙烯固相載體，合成RNA。14（2）化學(xué)合成DNA片段種類①DNA互補(bǔ)鏈合成引物包括PCR引物和測(cè)序引物。②DNALinker預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)化學(xué)合成的寡聚核苷酸片段，含有1種或幾種酶切位點(diǎn)，酶切可產(chǎn)生粘性末端。如果將含有多個(gè)酶切位點(diǎn)的Linker引入克隆載體中，就會(huì)形成多克隆位點(diǎn)（MCS），這種具有多克隆位點(diǎn)的連桿稱MCSLinker。③Adaptor是一種化學(xué)合成的寡聚核苷酸，含有一種以上的內(nèi)切酶位點(diǎn)。其與Linker的差別是Adaptor一端或兩端已有1種或兩種內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的粘性末端。④DNA芯片 指DNA片段以事先設(shè)計(jì)的排列方式固定在載波片或尼龍膜上組成的密集分子排列。固定的是探針，或者是靶DNA分子。15（3）目的基因的化學(xué)合成法1979年，Khorana等首次化學(xué)合成基因有生物活性。有全片段酶促連接法和酶促填充法。165．利用表達(dá)序列克隆目的基因（1）表達(dá)序列標(biāo)簽法分離目的基因Expressedsequencetag，簡(jiǎn)稱EST：指基因序列中一段能特異地標(biāo)記或表征基因的序列，通常它含有足夠的結(jié)構(gòu)信息以顯示出該基因與其他基因的差異，長(zhǎng)度一般為100~500bp。利用EST尋找新基因的策略即為表達(dá)序列標(biāo)簽法（ESTs）。最早由M.D.Adam在1991年建立并加以應(yīng)用，有的文獻(xiàn)稱之為cDNA測(cè)序法。基本步驟如下：①?gòu)慕M織特異性或細(xì)胞特異性的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆，進(jìn)行5‘端和3’端部分序列（約400bp）的測(cè)定。②通過(guò)對(duì)GenBank、EMBL或其他核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聯(lián)機(jī)檢索，可以檢測(cè)出所測(cè)定序列及其對(duì)應(yīng)的多肽氨基酸序列。將檢測(cè)的序列與基因庫(kù)中已知基因進(jìn)行同源比較，可檢測(cè)到已知基因和未知基因。③通過(guò)基因文庫(kù)的篩選或基因定位的方法分離目的基因。表達(dá)序列標(biāo)簽法分離目的基因有時(shí)可以從幾個(gè)不同基因的高度保守區(qū)得到相同的cDNA片斷，有時(shí)一個(gè)較大的基因不同外顯子又能表現(xiàn)為若干不同的cDNA。17（2）計(jì)算機(jī)克隆(siliconcloning)或生物信息學(xué)(bioinformatics)克隆新基因策略生物信息學(xué)克隆新基因策略是表達(dá)序列標(biāo)簽法的延伸和發(fā)展。生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息學(xué)等學(xué)科相互交叉而誕生的一門新興學(xué)科，核心內(nèi)容是通過(guò)對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲(chǔ)、檢索與分析，進(jìn)而達(dá)到揭示數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義的目的。做法：利用已發(fā)現(xiàn)的其他物種基因的cDNA序列為參照，在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)的EST數(shù)據(jù)庫(kù)（GebBank或EMBL等）中進(jìn)行同源搜索，獲得一系列同源的或部分重疊的EST序列，然后用GCG、DNAstar軟件中的alignment程序?qū)⑺鼈兤唇映梢粋€(gè)EST重疊群(contig)，經(jīng)過(guò)逐步延伸（cDNAsalking)及整合后可獲得全長(zhǎng)的cDNA序列；根據(jù)該推測(cè)的序列，可合成相應(yīng)的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，即可獲得該基因的cDNA片斷。局限性：難以尋找到一些表達(dá)量極低或者不表達(dá)的新基因類型，克隆基因的功能也有待鑒定。18（3）基因表達(dá)系列分析法基因表達(dá)系列分析法(serialanalysisofgeneexpression,簡(jiǎn)稱SAGE)可一次對(duì)大量基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，從中找出新的基因。原理（兩個(gè)）：①?gòu)霓D(zhuǎn)錄物某一特定位置上分離得到一段9~10bp的寡核苷酸序列標(biāo)簽(sequencetag,ST)，它含有確定的一個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄物的足夠信息量，可代表此轉(zhuǎn)錄物的特異性。理論上隨機(jī)排列的9bp片斷可區(qū)分262144（49）種轉(zhuǎn)錄物，人類的基因約僅有80000個(gè)轉(zhuǎn)錄子，因此，9個(gè)核苷酸序列可以代表所有轉(zhuǎn)錄子的特征。②多個(gè)序列標(biāo)簽（ST）能以錨定酶(anchoringenzyme,AE，識(shí)別位點(diǎn)為4堿基的限制性核酸內(nèi)切酶)識(shí)別位點(diǎn)序列相隔相互連成雙標(biāo)簽序列(ditag)的多聯(lián)體，將該多聯(lián)體序列克隆到一個(gè)載體中，用連續(xù)的方法進(jìn)行多聯(lián)體序列分析，再通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，確定每一種序列（ST）代表轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的種類和出現(xiàn)頻率，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄物的高效、快速和大量的分析。196．篩選目的基因片斷的差別雜交及減法雜交技術(shù)（1）差別雜交法差別雜交（differentialhybridization）或稱為差別篩選(differentialscreening)法，特別適用于分離在特定組織中、發(fā)育的特定階段表達(dá)的基因以及受生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的基因，亦可有效地用來(lái)分離經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因。方法是分別制備兩種不同細(xì)胞群體的mRNA提取物，其中一個(gè)群體含有一定比例的目的基因mRNA，另一個(gè)群體不含有目的基因mRNA。以這兩種總mRNA（或是它們的cDNA拷貝）為探針，分別對(duì)由表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)件的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。20（2）減法雜交技術(shù)減法雜交（subtractivehybridization）又叫做差減雜交克隆、扣除雜交、減數(shù)雜交或消減雜交等，該技術(shù)是通過(guò)DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫(kù)(subtractivelibrary)的方式來(lái)進(jìn)行目的基因克隆。減法雜交的對(duì)象可以是DNA，也可以是cDNA，相應(yīng)地稱為基因組DNA減法雜交和mRNA減法雜交。后者分析差異表達(dá)的基因，適于某些低豐度mRNA的cDNA克隆。mRNA減法雜交原理：從表達(dá)目的基因的組織中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后與無(wú)目的基因表達(dá)的組織中提取mRNA做過(guò)量雜交，在兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成cDNA/mRNA雙鏈雜交分子，而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段仍保持單鏈狀態(tài)，將這種單鏈cDNA分離出來(lái)即為差異表達(dá)的序列。21（3）基因表達(dá)系列分析法基因表達(dá)系列分析法(serialanalysisofgeneexpression,簡(jiǎn)稱SAGE)可一次對(duì)大量基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，從中找出新的基因。原理（兩個(gè)）：①?gòu)霓D(zhuǎn)錄物某一特定位置上分離得到一段9~10bp的寡核苷酸序列標(biāo)簽(sequencetag,ST)，它含有確定的一個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄物的足夠信息量，可代表此轉(zhuǎn)錄物的特異性。理論上隨機(jī)排列的9bp片斷可區(qū)分262144（49）種轉(zhuǎn)錄物，人類的基因約僅有80000個(gè)轉(zhuǎn)錄子，因此，9個(gè)核苷酸序列可以代表所有轉(zhuǎn)錄子的特征。②多個(gè)序列標(biāo)簽（ST）能以錨定酶(anchoringenzyme,AE，識(shí)別位點(diǎn)為4堿基的限制性核酸內(nèi)切酶)識(shí)別位點(diǎn)序列相隔相互連成雙標(biāo)簽序列(ditag)的多聯(lián)體，將該多聯(lián)體序列克隆到一個(gè)載體中，用連續(xù)的方法進(jìn)行多聯(lián)體序列分析，再通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，確定每一種序列（ST）代表轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的種類和出現(xiàn)頻率，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄物的高效、快速和大量的分析。第二節(jié)目的基因克隆沒有任何一種克隆方法能夠涵蓋所有好處，克隆步驟：1）克隆一個(gè)基因的方法：cDNA合成限制性核酸內(nèi)切酶消化機(jī)械剪切Mechanicalshearing2）加到載體上：選擇寄主和載體系統(tǒng)平末端連接Blunt-endligation使用連接頭Useoflinkermolecules粘性末端連接Ligationofcohesivetermini同聚物尾巴Homopolymertailing3）IntroducingtherecombinantDNAintoahostcell：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TransformationwithrecombinantplasmidDNA重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)染TransfectionwithrecombinantphageDNADNA體外包裝PackagingDNAinvitroChapter6第二節(jié)目的基因克隆ThereisnosinglecloningstrategythatwillcoverallrequirementsA.GenerationofgenefragmentB.JoiningtoavectorC.IntroducingtherecombinantDNAintoahostcellcDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingChoosethehost/vectorsystemBlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolymertailingLigationofcohesive

terminiTransformationwithrecombinantplasmidDNATransfectionwithrecombinantphageDNAPackagingDNAinvitrocDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingDirectChemicalsymthesisPackagingDNAinvitroTransformationwithRecombinantPlasmidDNATranfectionwithRecombinantPhageDNABlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolyertailingLigationofCohesiveterminiGenerationofgenefragmentChoosethehost/vectorsystemIntroducingtherecombinantDNAintoahostcellChapter6★看家基因（Housekeepinggenes）：又稱管家基因或持家基因：在所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物對(duì)維持細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和代謝功能是必不可少（forbasiccellularmetabolism），表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，在各生長(zhǎng)階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。表達(dá)只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié)。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等Housekeepinggenes:forbasiccellularmetabolism★每一個(gè)細(xì)胞都會(huì)生產(chǎn)大量的特殊的mRNA

Poly(A)+RNA:eachcelltypeproducedifferentabundanceclassesofparticularmRNAs.一、CloningfrommRNAChapter6★cDNA:complementaryDNA(copyDNA),poly(A)+RNAastempleReversetranscriptase=RTaseOligo(dT)primerAlkalinehydrolysis(orRNaseH)toremovemRNAstrandT4DNApolymerase,klenowfragmentS1nucleasetoproduceablunt-ended一、CloningfrommRNAChapter6mRNAAAAAAA-3’5’Chapter6RTaseHO-TTTTTT-5’AAAAAA-3’TTTTTT-3’TTTTTT-3’NaOHOHsscDNADNApolymeraseKlenowfragmentTTTTTT-3’S1nucleasedscDNASynthesisofcDNAmRNAAAAAAACCCC-3’5’TTTTTT-5’TTTTTT-5’AlkalinesucrosegradientdscDNAAAAAAA-3’5’TTTTTT-5’cDNA3’CTerminaltransferase+dCTP3’-CCCCCCRTaseTTTTTT-5’3’-CCCCCC5’-GGGGGGAddoligo(dG)primerChapter6Oligo（dG）-primedsecond-strandcDNAsynthesisCCCC3’-C★blunt-endligation:S1nucleasedestroytheprotrudingendsofDNA;DNApolymerase(klenowfragment)fillingtheprotrudingendsofDNA.Maindisadvantage:1)isaninefficientprocess,requirehighconcentrationDNAforligation;2)vectorself-ligatetoproducecircularmolecules

ortheinsert/vectorDNAsmayformconcatemersinsteadofbimolecularrecombinants,usephoshpatase(eitherBAPorCIP)topreventself-ligation;3)cloningsitedisappearintherecombinantDNA2CloningcDNAinplasmidvectorsTwomethods:1)Ligationofblunt-end2)Ligationofcohesiveterminia.Useoflinkermoleculesb.HomopolymertailingCCGAATTCGGGGCTTAAGCCLinkers:

areself-complementaryoligomersthatcontainarecognitionsequenceforaparticularrestrictionenzyme.DNAligaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCC5’-AATTCGGGCCCCGGGCTTAA-5’EcoRI＋Adaptors:

aresingle-strandednon-complementaryoligomersthatmaybeusedinconjunctionwithlinkers,whenannealedtogetherandbeaddedtothecDNAtoprovidesticky-endcloningwithoutdigestionofthelinkers.OH-GATCCCCGGGDNAligaseCCCGGGGGGCCCCTAG-OH-5’GGGCCCGGATCCCCTAGGBamHI+OH-GATCCCCGGGGGGCCC5’-OH-GATCCCCGGGGGGCCCCCCGGG

GGGCCC

HpaIIHomopolymertailing:

theenzymeterminaltransferaseisusedtoaddhomopolymersofdA,dT,dGordCtoaDNAmolecule.PstIvectorCCCCCCCC-3’3’-CCCCCCCCInsertCTGCAGGGGGGGG-3’G3’-GGGGGGGGACGTCGPstIsiteGGGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGGGGACGT

TGCAGCCCCCCCCCCCCCCCCPstIsiteEnzymedigestionTerminaltransferase+dCPstIdigestionTerminaltransferase+dGDNAligaseTargetgene★Mainadvantage:1)packaginginvitromaygeneratetherecombinantphage,whichincreasestheefficiencyofthecloningprocess.

2)mucheasiertostoreandhandlelargenumbersofphageclonesthanplasmids.3CloningcDNAinbacteriophagevectorsIfalargenumberofrecombinantswasrequired,andalow-abundancemRNAwastobecloned,phagevectorsmaybemoresuitable.CloningcDNAinλvectorsusinglinkers:EcoRImethylaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCAddEcoRIlinkersdscDNAMeMeCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCDigestwithEcoRILigateInsertvectorvectorLAλ

vectorRA★genomiclibrary:isoftenusedtodescribeasetofclonesrepresentingtheentiregenomeofanorganism.TodeterminetheintronsToexaminethecontrolsequencesresponsibleforregulatinggeneexpression二、CloningfromgenomicDNA1Genomiclibraries★aimofconstructingagenomiclibraryisforisolatingatargetDNAsequence.★

Clonebank(library):Acollectionofindependentclonesistermedaclonebankorlibrary估計(jì)基因組文庫(kù)大小的經(jīng)驗(yàn)（empiricalformula）公式：

N=ln(1-P)/ln(1-a/b)N:thenumberofclonesrequiredP:desiredprobabilityofaparticularsequencebeingrepresented(0.95or0.99)a:theaveragesizeoftheDNAfragmenttobeclonedb:thesizeofthegenomeorganismGenomeSize(kb)No.clonesN,P=0.9520kbinserts45kbinsertsEscherichiacoli(bacteria)4.0×1036.0×1032.7×103Saccharomycescerevisiae(yeast)1.4×1042.1×1039.3×102Arabidopsisthaliana(simpleplant)7.0×1041.1×1044.7×103Drosophilamelanogaster(fruitfly)1.7×1052.5×1041.1×104Stroglyocentrotus

purpuratus(seaurchin)8.6×1051.3×1055.7×104Homosapiens(human)3.0×1064.5×1052.0×105Triticumaestivum(hexaploidwheat)1.7×1072.5×1061.1×106Geneticlibrarysizesforvariousorganisms選擇哪種載體用于基因組文庫(kù)構(gòu)建？Whichvectorisusedtochooseforconstructionofgeneticlibrary?λphagevector：有效容納量是15kbcosmidvector：有效容納量是45kb建立基因組文庫(kù)的一般程序：1．載體DNA片段的制備載體DNA分離純化限制酶切脫磷酸化反應(yīng)3.供體與載體DNA連接提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中總DNA濃度和兩種DNA分子的摩爾數(shù)比率。2．供體DNA片段的制備機(jī)械剪切法總DNA分離純化分離特定大小DNA片段酶法（部分酶切、完全酶切）4.重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫(kù)的擴(kuò)增利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接好的重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，讓其自主復(fù)制，重組DNA分子被擴(kuò)增（重組子比率可能發(fā)生變化）。5.基因組文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)1）文庫(kù)規(guī)模----隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)粒DNA，電泳測(cè)定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計(jì)算文庫(kù)大小。2）重組頻率----頻率越高，質(zhì)量越高，可大大減輕后續(xù)篩選基因工作量。CloningDNAinλvectorsusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvectorCloningDNAinλvectorsusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvectorThemolecularweightoftheDNAafterisolationfromtheorganism.ThemethodusedtofragmenttheDNA.文庫(kù)的連接、包裝和擴(kuò)增TwomainconsiderationwhenpreparingDNAfragmentforcloning:Foracompletelyrandomlibrary,DNAmolecularweightshouldbeveryhigh.★100kbisavailable.★

Fragmentationcanbeachievedeitherbymechanicalshearingorbypartialdigestionwitharestrictionenzyme.CTAGAnnealBamHI

Sau3AGCCTAGGATCCGGATC

CTAGGATC

GCCTAGGATC

CTAGGATCCGCloningSau3AfragmentsintoBamHIsite5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI

5’-NGATCN-3’3’-NCTAGN-5’Sau3AEBSEBSEMBL4LeftarmRightarmSSLeftarmRightarmS/BS/BGATCCTAGGATCCTAGLigationofSau3A–cutDNAintotheλreplacementvectorEMBL45’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI

5’-NGATCN-3’3’-NCTAGN-5’Sau3AEMBL4GATCCTAGGATCCTAGEBSEBSLeftarmRightarmStufferfragmentSSLeftarmS/BGATCCTAGGATCCTAGS/BRightarmInsertDNASau3AcohesiveendSau3Acohesive

endLigationofSau3A-cutDNAintotheλreplacementvectorEMBL4GATCCTAGGATCCTAGcoscosInsertInsertInsertcoscosLALALARARAPackagedinvitroConcatemericrecombinantDNAPrimarylibraryAmplificationoflibraryPlatingthepackagedphageonasuitablehostofE.coli,thenresuspendingtheplaquesbywashingtheplateswithabuffersolutionConcatemericrecombinantDNAandamplificationoflibrary

4.更先進(jìn)的克隆技術(shù)Advancedcloningstrategies1)SynthesisandcloningofcDNAOkayama–Berg法1）T引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于合成第一條cDNA鏈2）G引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于合成第二條cDNA鏈3）第一條cDNA鏈合成：T引物與mRNA退火反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)4）第二條cDNA鏈的合成：a.

第一條cDNA鏈3’-末端加尾（dCTP）b.

限制酶切除去載體上所加的多聚C尾巴c.與G引物退火d.

除去RNAe.

合成第二條cDNA鏈5）cDNA文庫(kù)的形成—轉(zhuǎn)化

2)ExpressionofclonedDNAmoleculesPromoter（啟動(dòng)子）:areregionswithaspecificbasesequence,towhichRNApolymerasewillbind.Strongpromoter:強(qiáng)啟動(dòng)子Weakpromoter:弱啟動(dòng)子Induciblepromoter:誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在原核生物中（Inprokaryoticpromoter）：Consensussequence:Inprokaryoticpromoter,twomainregionsisimportant:-10region=Pribnowbox:5’-TATAAT-3’-35region:5’TTGACA-3’真核生物中（Ineukaryoticpromoter）:Enhancers（增強(qiáng)子）:maybelocatedhundredsorthousandsofbase-pairsupstreamfromtheTcstartsite.-25position：CAATbox.Around-25positionwiththeconsensussequence5’-TATAAAT-3’(theTATAorHognessbox)andasequenceinthe-75regionwiththeconsensus5’-GG(T/C)CAATCT-3’,knownastheCAATbox.EcoRISacIPstIHindIII1）SacI2）TdT+dTTPEcoRISacITTTTTHindIIITTTTTAAAAAmRNAAMV-RT+dNTPTTTTTTTTTTAAAAATdT+dCTPTTTTTAAAAATTTTTCCCCEcoRISacIPstIHindIIICCCC1）HindIII2）取大片段TTTTTCCCCSacIHindIIIPstI1)PstI

2)TdT+dGTPEcoRIGGGGHindIIIGGGGPstISacI1）HindIII2）取小片段HindIIIGGGGBAC:bacterialartificialchromosomesYAC:yeastartificialchromosomesCloninglargeDNAfragmentsinBACandYACTEL