動(dòng)物細(xì)胞融合與單體克隆抗體

2.2.2

動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體第一頁，共三十三頁。本節(jié)要點(diǎn)一、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)二、動(dòng)物細(xì)胞融合基本原理三、誘導(dǎo)方式？與植物細(xì)胞雜交的不同的是？四、植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較五、獲得抗體的傳統(tǒng)方法六、單克隆抗體的含義？如何制備？?jī)?yōu)點(diǎn)？七、整個(gè)制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第二頁，共三十三頁。一、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：

動(dòng)物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過程。融合后形成的具有兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。第三頁，共三十三頁。二、動(dòng)物細(xì)胞融合基本原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性三、誘導(dǎo)方式物理法：化學(xué)法：生物法：滅活的病毒電激、振動(dòng)、離心聚乙二醇（PEG）如：仙臺(tái)病毒為什么要用滅活的病毒？仙臺(tái)病毒物理/化學(xué)方法喪失感染活性保留融合活性第四頁，共三十三頁。滅活的病毒滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞第五頁，共三十三頁。四、植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)方法用途獲得雜種植株細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法（同左）制備單克隆抗體滅活的病毒第六頁，共三十三頁。為什么“甲流”康復(fù)者或接種疫苗1月以上者的血漿會(huì)成為救治重癥“甲流”患者的妙藥？血漿中的抗體會(huì)與“甲流”病毒反應(yīng)，從而將病毒消滅。第七頁，共三十三頁。五、獲得抗體的傳統(tǒng)方法把某種抗原反復(fù)注射到動(dòng)物體內(nèi)，然后從動(dòng)物血清中分離出所需的抗體。缺點(diǎn)：人們發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞盡管可以產(chǎn)生多達(dá)百萬種以上的特異性抗體，但是每一個(gè)B細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。怎樣才能獲得大量的單一性抗體呢？產(chǎn)量低純度低特異性差第八頁，共三十三頁?？乖瓫Q定簇：抗原表面具有的某些特定的化學(xué)基團(tuán)，能決定抗原特異性，是免疫細(xì)胞識(shí)別抗原的重要依據(jù)。各種抗原的決定簇?cái)?shù)目不同，同一抗原的決定簇可能有多種。第九頁，共三十三頁。抗體與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合第十頁，共三十三頁。

抗體由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?第十一頁，共三十三頁。怎樣才能獲得單一性抗體？大量克隆單一的B淋巴細(xì)胞其壽命僅有幾天，無法長(zhǎng)期體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)骨髓瘤細(xì)胞無限增殖雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體無限增殖細(xì)胞融合第十二頁，共三十三頁。G.Kohler

C.Milstein

英國(guó)科學(xué)家米爾斯坦和科勒于1975年設(shè)計(jì)和實(shí)踐了這個(gè)想法，并獲得成功。摘得1984年諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第十三頁，共三十三頁。六、單克隆抗體的制備用抗原免疫小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合多種細(xì)胞第十四頁，共三十三頁。由于培養(yǎng)基中缺乏相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物，骨髓瘤細(xì)胞死亡B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)幾天后死亡雜交瘤細(xì)胞置于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)第十五頁，共三十三頁。細(xì)胞膜的流動(dòng)性滅活病毒、PEG、電激等融合后的細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，形成完整的雜交細(xì)胞誘導(dǎo)的手段？融合后細(xì)胞的類型？AB雜種細(xì)胞遺傳物質(zhì)有什么特點(diǎn)？三種AA、AB、BB（A、B）含兩種生物的遺傳物質(zhì)1.2動(dòng)物細(xì)胞融合過程原理？雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)：既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量增殖。第十六頁，共三十三頁。①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，可是能不斷分裂增殖。你想到篩選雜交瘤細(xì)胞的方案了么？

小資料：第十七頁，共三十三頁。在培養(yǎng)液中加入氨基蝶呤，收集增殖細(xì)胞！加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞因?yàn)榭梢岳昧馨图?xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。第十八頁，共三十三頁。通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，再由這些單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。②再篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞第十九頁，共三十三頁。陽性孔方法——抗原-抗體雜交法

在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的原理和方法是不相同的。第二十頁，共三十三頁。多孔細(xì)胞培養(yǎng)板陽性克隆的篩選和克隆化培養(yǎng)用培養(yǎng)液稀釋第二十一頁，共三十三頁。注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)由單個(gè)雜交瘤細(xì)胞通過克隆，所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體。單克隆抗體第二十二頁，共三十三頁。七、整個(gè)制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：第二次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細(xì)胞篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。第二十三頁，共三十三頁。第二十四頁，共三十三頁。第二十五頁，共三十三頁。三、單克隆抗體的特點(diǎn)和應(yīng)用“生物導(dǎo)彈”＝單克隆抗體＋藥物診斷試劑用于治療疾病1、特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，產(chǎn)量高。2、應(yīng)用：用于運(yùn)載藥物優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確，高效，快速第二十六頁，共三十三頁。第二十七頁，共三十三頁。2.3單克隆抗體的應(yīng)用診斷試劑——最廣泛應(yīng)用準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速單克隆抗體最主要的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并能大量制備。第二十八頁，共三十三頁。“生物導(dǎo)彈”＝單克隆抗體＋藥物單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭治療疾病和運(yùn)載藥物主要用于治療癌癥治療，單克隆抗體作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”，準(zhǔn)確殺傷癌變細(xì)胞。第二十九頁，共三十三頁。練習(xí)1、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)最重要的用途是（）A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新物種D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞B2、單克隆抗體是由下列哪種細(xì)胞產(chǎn)生的（）

A.B淋巴細(xì)胞B.T淋巴細(xì)胞C.骨髓瘤細(xì)胞D.雜交瘤細(xì)胞D3、單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是（）①淋巴細(xì)胞②小鼠骨髓瘤細(xì)胞③B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞④小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞⑤雜交瘤細(xì)胞A.②④B.①③⑤C.①②③④D.②③C第三十頁，共三十三頁。B體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞群注射到小鼠腹腔AC

4.下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的實(shí)驗(yàn)方案制備單克隆抗體不能，沒有將抗原注入小鼠體內(nèi)，無法獲得產(chǎn)生單一抗體的B淋巴細(xì)胞。(1).該實(shí)驗(yàn)方案的目的是：________________(2).該方案能達(dá)到預(yù)期效果嗎？為什么？(3).A是從小鼠的脾臟中取得__________該細(xì)胞能夠產(chǎn)生______。(4).圖中B為________________過程，常用_________________作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承___________的遺傳特性，既能__________,又能___________。(5).C過程指細(xì)胞培養(yǎng)，該過程包括________培養(yǎng)和__________培養(yǎng)兩個(gè)階段。B淋巴細(xì)胞抗體細(xì)胞融合滅活的病毒雙親細(xì)胞分泌抗體無限增殖原代傳代第三十一頁，共三十三頁。BBBB瘤瘤瘤