阿霉素誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,藥學(xué)論文

阿霉素誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,藥學(xué)論文阿霉素〔adriamycin,ADM〕為蒽環(huán)類(lèi)抗生素，抗瘤譜較廣，療效高，是臨床常用的抗腫瘤藥物。除白血病外，其對(duì)膀胱癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、軟組織肉瘤以及侵蝕性淋巴瘤等都有療效[1].阿霉素抗腫瘤作用機(jī)制包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期以及使腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬等[2].文獻(xiàn)報(bào)道，阿霉素可能通過(guò)影響B(tài)cl-2/Bax[3]、JNK凋亡通路[3]、p53凋亡通路[4]以及激活腺苷酸活化蛋白激酶〔AMPK〕[5]等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其確切機(jī)制仍未特別明了。細(xì)胞凋亡早期出現(xiàn)的細(xì)胞容積減小稱為凋亡性細(xì)胞皺縮〔apoptoticvolumedecrease,AVD〕,是具有普遍性意義的細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性事件。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究表示清楚，氯通道介入過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞凋亡[6]、紫杉醇[7]和丹參酮[8]誘導(dǎo)的低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果提示多種抗腫瘤藥物都可能通過(guò)激活氯通道引起AVD,繼而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其抗癌作用。本研究旨在討論阿霉素能否通過(guò)激活細(xì)胞氯通道而誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞皺縮，從離子通道的角度來(lái)討論阿霉素誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。1材料與方式方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)用含10%小牛血清、雙抗〔1105UL-1青霉素與100mgL-1鏈霉素〕的RPMI1640生長(zhǎng)液，在37C恒溫培養(yǎng)箱〔5%CO2、飽和濕度〕內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)低分化鼻咽癌細(xì)胞〔CNE-2Z〕,每?jī)商靷鞔?次。實(shí)驗(yàn)前取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2Z細(xì)胞，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，收集、重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于直徑22mm的圓形玻片上，置入培養(yǎng)箱使細(xì)胞貼壁，待細(xì)胞貼壁1h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2主要試劑與藥品鹽酸阿霉素固體粉末購(gòu)于上海生工生物有限公司，用二甲基亞砜〔DMSO〕溶解，配制成濃度為2.5mmolL-1的儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存在4℃冰箱中，使用前稀釋至終濃度。氯通道阻斷劑5-nitro-2-〔3-phenylpropylamino〕-benzoate〔NPPB〕購(gòu)自Sigma公司，溶于dimethylsulfoxide〔DMSO〕中，配成100mmolL-1的儲(chǔ)存液，工作濃度為100molL-1.等滲灌流液組成〔mmolL-1〕:10HEPES,0.5MgCl2,70NaCl,140D-mannitol,2CaCl2,用冰點(diǎn)浸透壓計(jì)〔Osmomat030,Gono2tec〕調(diào)節(jié)溶液浸透壓至300mOsmolL-1,用Tris-base調(diào)節(jié)pH至7.4.1.3細(xì)胞容積測(cè)量將貼有細(xì)胞的玻片置于灌流槽內(nèi)，在倒置相差顯微鏡〔IX71,Olympus,日本〕下選擇固定視野，用圖像分析軟件〔Image-ProPlus6.3,MediaCybernetics,USA〕控制數(shù)字式攝像機(jī)〔RETIGA4000R,QImaging,Canada〕,進(jìn)行連續(xù)拍攝，每2min拍攝一幅，直至2h.拍攝的圖片用ScionImage圖像分析軟件〔ScionCorporation〕處理，測(cè)量細(xì)胞直徑與面積，用下面公式計(jì)算細(xì)胞容積〔V〕:V=4/3〔直徑/2〕3,并標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞容積〔Vst〕:Vst=〔Vt/Vo〕100%〔Vt:細(xì)胞的實(shí)際容積，Vo:藥物刺激前即等滲條件下〔對(duì)照〕的細(xì)胞平均容積〕.實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組〔Iso〕、阿霉素組〔ADM,2.5molL-1〕、氯通道阻斷劑NPPB組〔100molL-1〕、阿霉素〔2.5molL-1〕+NPPB〔100molL-1〕組。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為室溫〔20℃~24℃〕.1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞種植于6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h,按上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理。36h后，收集細(xì)胞，用PBS沖洗，并用預(yù)冷的70%乙醇于-20℃固定30min.PBS清洗并離心，參加propidiumiodide〔PI,50mgL-1〕,室溫避光染色15min.用流式細(xì)胞儀〔CoulterEPTCSXL-31240,Coulter,USA〕進(jìn)行分析。1.5膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)EPC-7膜片鉗放大器〔ListElectronic,Germany〕用于記錄全細(xì)胞電流，CED1401〔Cambridge,UK〕用于數(shù)字化〔采樣頻率3kHz〕電流和電壓信號(hào)。拉制的電極是硼硅酸鹽毛細(xì)玻璃管，其內(nèi)徑為0.86mm,外直徑為1.5mm,內(nèi)含細(xì)長(zhǎng)絲，于垂直微電極拉制器〔PB-7〕上，分兩步拉制。將電極內(nèi)液充灌至電極容積的1/3至2/3間，此時(shí)阻抗約為〔5-10〕M。全細(xì)胞記錄形式構(gòu)建完成后，開(kāi)場(chǎng)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。將細(xì)胞鉗制在氯離子的平衡電位〔0mV〕.按指令電壓的順序〔40,0和80mV〕循環(huán)記錄氯電流變化。每一電位持續(xù)時(shí)間約200ms,兩電位之間間隔4s.構(gòu)成全細(xì)胞記錄后，補(bǔ)償電容。灌流等滲液3min后，參加阿霉素，連續(xù)觀察氯電流變化，待阿霉素激活氯電流達(dá)峰值，并平衡5min后，灌流含氯通道阻斷劑與阿霉素的等滲液，觀察氯電流變化，直至電流抑制到最小值，并平穩(wěn)3min以上。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EPC〔CED,Cambridge,UK〕軟件分析。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為室溫〔20℃~24℃〕.全細(xì)胞膜片鉗記錄所需電極內(nèi)液組成〔mmolL-1〕:1EGTA[乙二醇-雙-〔2-氨基乙醚〕四乙酸],1.2MgCl2,70N-methyl-D-glucaminechloride〔NMDG-Cl〕,10HEPES,140D-mannitol和2ATP,并用Tris-base調(diào)節(jié)pH至7.25.1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS12.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，數(shù)據(jù)用珋xs表示，采用方差分析〔ANOVA〕檢驗(yàn)差異的顯著性。2結(jié)果2.1氯通道阻斷劑抑制阿霉素誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡用流式細(xì)胞儀檢測(cè)阿霉素誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不加任何藥物處理的空白對(duì)照組細(xì)胞，其凋亡率為〔1.742.34〕%〔n=3〕〔Fig1A〕,而用2.5molL-1的阿霉素處理36h的細(xì)胞，凋亡率增加至〔23.563.45〕%〔n=3,P0.01,vscontrol〕〔Fig1C〕.為了討論氯通道在阿霉素誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡中的作用，我們觀察了氯通道阻斷劑NPPB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的凋亡的影響。結(jié)果顯示，單純用NPPB〔100molL-1〕處理的細(xì)胞，凋亡率為〔1.581.35〕%,與空白對(duì)照組相比，差異沒(méi)有顯著性〔n=3,P0.05,vscontrol〕〔Fig1B〕.NPPB〔100molL-1〕與阿霉素〔2.5molL-1〕共同處理細(xì)胞，CNE-2Z細(xì)胞凋亡率為〔13.292.78〕%,與阿霉素組凋亡率〔23.563.45〕%相比，差異有顯著性〔n=3,P0.01〕〔Fig1D〕.2.2氯通道阻斷劑抑制阿霉素誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡性容積減小細(xì)胞圖像分析結(jié)果顯示，等滲液灌流細(xì)胞2h,細(xì)胞容積及形態(tài)基本保持不變〔Fig2A〕.而用含2.5molL-1阿霉素的等滲液灌流細(xì)胞10min內(nèi)，便可觀察到CNE-2Z細(xì)胞的凋亡性容積減小的發(fā)生，在連續(xù)觀察120min的經(jīng)過(guò)中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積逐步減小，皺縮〔Fig2B〕.而阿霉素和NPPB聯(lián)合作用120min時(shí)的細(xì)胞體積并沒(méi)有減小〔Fig2C〕.Fig2D顯示了藥物作用前后120min細(xì)胞容積變化百分率，阿霉素灌流120min時(shí)細(xì)胞體積減小至〔90.360.42〕%〔n=21,P0.01〕,阿霉素和NPPB聯(lián)合作用組細(xì)胞體積為〔102.830.44〕%〔n=27〕,與阿霉素組相比，差異有顯著性〔P0.01〕.單純用NPPB灌流細(xì)胞，細(xì)胞體積有所增大，120min時(shí)為〔104.050.65〕%〔n=14〕.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，氯通道阻斷劑NPPB能夠明顯抑制阿霉素誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞容積減小，提示阿霉素可能通過(guò)激活氯通道而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，早期發(fā)生的凋亡性容積減小。2.3阿霉素激活的CNE-2Z細(xì)胞氯電流為了進(jìn)一步驗(yàn)證阿霉素能否通過(guò)激活細(xì)胞氯通道而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡性容積減小，我們用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄了阿霉素激活的CNE-2Z細(xì)胞氯電流。Fig3A所示為阿霉素誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞氯電流全程圖。在等滲條件下，可記錄到一個(gè)微弱且穩(wěn)定的背景氯電流〔Fig3A、B〕.胞外灌流阿霉素，能夠明顯激活氯電流，該電流具有外向優(yōu)勢(shì)，外向電流明顯大于內(nèi)向電流，且未見(jiàn)明顯時(shí)間依靠性失活〔Fig3A、C〕.該電流的翻轉(zhuǎn)電位為〔-3.000.84〕mV〔n=8〕,接近氯離子平衡電位。當(dāng)鉗制電壓為80mV時(shí)，該電流的平均峰值高達(dá)〔-31.672.38〕pA/pF〔-80mV〕、〔49.413.23〕pA/pF〔+80mV〕〔n=6,P0.01,vsIso〕〔Fig3E〕.在阿霉素激活氯電流且達(dá)平穩(wěn)的基礎(chǔ)上，參加氯通道阻斷劑NPPB〔100molL-1〕,氯電流迅速降低〔Fig3A、D〕.其對(duì)外向電流的抑制率為〔79.966.57〕%〔+80mV〕,對(duì)內(nèi)向電流抑制率為〔76.644.66〕%〔-80mV〕〔n=5,P0.01,vsADM〕〔Fig3E〕,對(duì)內(nèi)外向電流間的抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氯通道在阿霉素誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡早期的經(jīng)過(guò)中起重要作用。在所有實(shí)驗(yàn)中，用來(lái)配制NPPB的DMSO在灌流液中的終濃度低于1%〔V/V〕,其對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞容積減小及激活的氯電流沒(méi)有影響，且24h內(nèi)無(wú)細(xì)胞毒性。3討論細(xì)胞凋亡異常在腫瘤以及很多疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡發(fā)生于生理以及病理狀態(tài)下對(duì)不同刺激的應(yīng)答經(jīng)過(guò)中，具有一系列生化和形態(tài)學(xué)特征，其伴隨著細(xì)胞進(jìn)行性的體積縮小，以及線粒體細(xì)胞色素C釋放、caspase激活、核固縮、DNA片段化和凋亡小體的構(gòu)成[9]等。華而不實(shí)早期細(xì)胞皺縮或凋亡性容積減小〔AVD〕是在等滲狀態(tài)下發(fā)生的細(xì)胞體積縮小，具有普遍的意義。研究表示清楚[10],AVD發(fā)生于細(xì)胞色素C釋放、caspase活化以及DNA斷裂之前，是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性事件。鑒于AVD在細(xì)胞凋亡早期觸發(fā)機(jī)制中的關(guān)鍵性作用，深切進(jìn)入討論AVD的發(fā)生、發(fā)展經(jīng)過(guò)及其機(jī)制，對(duì)于揭示凋亡規(guī)律有重要意義。AVD的發(fā)生被以為與細(xì)胞內(nèi)K+與Cl-濃度減小有關(guān)[11].在凋亡早期，凋亡誘導(dǎo)劑激活鉀通道與氯通道，促使K+與Cl-外流，并驅(qū)動(dòng)水的外流，致使細(xì)胞體積減小發(fā)生AVD,進(jìn)而誘發(fā)凋亡[6,12].氯通道介入細(xì)胞的多種生理功能，如細(xì)胞增殖[13]、遷移[14]、凋亡[6]、細(xì)胞溶血[15],還可介入冰片引起的細(xì)胞體積減小經(jīng)過(guò)[16].我們前文報(bào)道，中藥丹參酮發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制可能是通過(guò)激活氯通道引起氯離子和水外流，誘導(dǎo)AVD發(fā)生，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[8].阿霉素作為一種常用的抗腫瘤藥物，它能否可以能通過(guò)激活氯通道誘導(dǎo)AVD和細(xì)胞凋亡？當(dāng)前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用活細(xì)胞影像系統(tǒng)實(shí)時(shí)拍攝細(xì)胞圖像，分析細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞容積變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，在阿霉素作用的10min內(nèi)，便可觀察到CNE-2Z細(xì)胞凋亡性容積減小的發(fā)生；而在阿霉素繼續(xù)作用的2h內(nèi)，細(xì)胞容積持續(xù)減小。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到阿霉素誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡，氯通道阻斷劑NPPB能夠完全阻抑CNE-2Z細(xì)胞凋亡性容積減小、明顯阻抑細(xì)胞凋亡，提示阿霉素能夠激活CNE-2Z細(xì)胞氯通道，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生AVD和細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，我們用膜片鉗法記錄CNE-2Z細(xì)胞阿霉素激活的全細(xì)胞電流，直接觀察阿霉素對(duì)氯通道的激活作用。結(jié)果顯示，細(xì)胞外灌流阿霉素可激活一個(gè)外向電流，該電流與氯離子跨細(xì)胞流動(dòng)所產(chǎn)生的電流一致，其翻轉(zhuǎn)電位接近氯離子的平衡電位-0.9mV〔根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞外灌流液及電極內(nèi)液配方計(jì)算而得〕,該電流可被氯通道阻斷劑NPPB抑制，由此推知該電流為氯通道所介導(dǎo)的氯電流。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為