感受態(tài)細(xì)胞制備

1*1010感覺(jué)

態(tài)

細(xì)

胞

制

備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握氯化鈣法制備感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的原理、方法和技術(shù)；2、掌握電轉(zhuǎn)變感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的制備原理及方法；3、學(xué)習(xí)并掌握感覺(jué)態(tài)細(xì)胞效價(jià)的檢測(cè)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理在基因克隆技術(shù)中，所謂轉(zhuǎn)變是指質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒被導(dǎo)入受體細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的選擇標(biāo)志基因，并在必定的培育條件下，在選擇性培育基上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)變子的過(guò)程。質(zhì)粒一定經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)變進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，才能進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲取大批的克隆基因。細(xì)菌汲取外源DNA的能力最高時(shí)的狀態(tài)被稱(chēng)為感覺(jué)態(tài)細(xì)胞。有些種類(lèi)的細(xì)菌在其生長(zhǎng)的任一階段都處于感覺(jué)態(tài)，而另一些細(xì)菌只有處于某個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)，才會(huì)處于感覺(jué)態(tài),如大腸桿菌。大腸桿菌的感覺(jué)態(tài)細(xì)胞制備原理是取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久的細(xì)菌處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)變混雜物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊辦理，促使細(xì)胞汲取DNA復(fù)合物，在豐富培育基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)變的細(xì)菌中，重組子中基因獲取表達(dá)。對(duì)這類(lèi)現(xiàn)象的一種解說(shuō)是CaCl2能使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性加強(qiáng)，目前還可以使用電激的方法，經(jīng)過(guò)瞬時(shí)的高壓電流，在細(xì)胞上形成孔洞，使外源DNA進(jìn)入胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。電激轉(zhuǎn)變的效率常常比化學(xué)法高出1到2個(gè)數(shù)目級(jí)，達(dá)到1x108轉(zhuǎn)變子每1μgDNA，甚至1x109轉(zhuǎn)變子每1μgDNA，所以常用于文庫(kù)成即刻的轉(zhuǎn)變或遺傳挑選化學(xué)法簡(jiǎn)單、迅速、穩(wěn)固、重復(fù)性好，菌株合用范圍廣，感覺(jué)態(tài)細(xì)菌可以在-70℃保存，所以被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)變。物理制備法：電轉(zhuǎn)法，除化學(xué)法轉(zhuǎn)變細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)變法，電擊法不需要早先引誘細(xì)菌的感覺(jué)態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)變率最高能達(dá)到109~1010轉(zhuǎn)變子/μg閉環(huán)DNA。因操作簡(jiǎn)易，越來(lái)越為人們所接受。轉(zhuǎn)變后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)變子，依據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)變子總數(shù)和轉(zhuǎn)變頻率，公式以下：轉(zhuǎn)變總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)變反應(yīng)原液整體積／涂板菌液體積轉(zhuǎn)變率（轉(zhuǎn)變子數(shù)／每μg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)變子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(μg)理論上轉(zhuǎn)變率最高為每微克地標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)變的菌落數(shù)為三、實(shí)驗(yàn)資料實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫振蕩儀、恒溫培育箱、低溫常速離心計(jì)、移液槍、錐形瓶、離心管、LB液體培育基、實(shí)驗(yàn)試劑：0.1MCaCl2溶液、含10%甘油的0.1MCaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5α、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）化學(xué)感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的制備1）菌種的活化：取-70℃的冰箱中感覺(jué)態(tài)細(xì)胞DH5α、Top10、DE3、BL21在LB的平板長(zhǎng)進(jìn)行劃線分別。2）菌種的前培育：從LB平板上挑取相應(yīng)的單菌落,接種于10mlLB液體培育基中，37℃振蕩培育過(guò)夜至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期。3）菌種的準(zhǔn)備：將該四種菌懸液以1:100的比率分別接種于四個(gè)不含有抗生100mlLB液體培育基錐形瓶中,37℃振蕩培育大體2.5小時(shí)至OD=0.4~0.5。（4）感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的制備：①把上述的錐形瓶放到冰水迅速使其冷卻。把100mL培育液平均分成兩份到50mL離心管中，在4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10min。②棄去上清液，加入30mL0.1M的CaCl2溶液，輕輕混勻，在冰水中靜置30min。③棄去上清液，加入30mL0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管輕輕吹吸讓積淀充分混勻，在冰水中靜置30min。④從冰水中拿出4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10min，棄去上清液并用移液槍輕輕地把剩余的液體吸干凈，加入0.5mL含10%甘油的0.1MCaCl2溶液。用巴氏管輕輕吸起液體打到壁上使積淀混勻并擱置在冰上。⑤把液氮倒到小的塑料盒子里，在離心管架子上擺放好0.5ml離心管，用剪過(guò)的移液槍頭進(jìn)行分裝，每個(gè)離心管中分裝40μL懸浮液。⑥迅速蓋好蓋子放入到液氮中，使之迅速冷凍，而后放到標(biāo)有感覺(jué)態(tài)細(xì)胞種類(lèi)、制作者和時(shí)間的袋中，-70℃保存。（二）電轉(zhuǎn)變的感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的制備第1、2、3步同化學(xué)轉(zhuǎn)變的感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的制備過(guò)程的1、2、3三步同樣。（4）制備感覺(jué)態(tài)細(xì)：①把上述的錐形瓶放到冰水迅速使其冷卻。把100mL培育液平均分成兩份到50mL離心管中，在4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10min。②棄去上清液，加入30mL三蒸水，用巴氏管吸起液體打到離心管壁上使積淀充分混勻，在4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘下離心10min，倒去上清。重復(fù)兩次；③再加入30mL含10%甘油水溶液，在4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘下離心10min，重復(fù)一次。④棄去上清液，加入0.5mLGYTmedium(含有10%Glysiron、0.125%YeastExtraction、0.25%Trypton)，擱置在冰上。5）準(zhǔn)備好成有液氮的塑料盒子和把0.5mL離心管若干放到離心管架子上，將懸浮的感覺(jué)態(tài)細(xì)胞分裝在離心管中，每管40μl，迅速蓋好蓋子放入到液氮中，使之迅速冷凍，而后放在標(biāo)有感覺(jué)態(tài)細(xì)胞種類(lèi)、制作者和時(shí)間的袋中，-70℃保存。（三）效價(jià)檢測(cè)1、化學(xué)轉(zhuǎn)變：（1）取化學(xué)轉(zhuǎn)變感覺(jué)態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，同時(shí)把標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PUC19稀釋十倍置于冰上。2）在含有40μl感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的0.5ml離心管中加入1μL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒充分混勻。冰上靜置30min。3）將離心管置于42℃干式恒溫器上90s，而后迅速放回冰上，使細(xì)胞冷卻2～3min。4）向離心管中加入已預(yù)熱的無(wú)菌LB培育液400μL，再轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，37℃恒溫振蕩培育45～60min。5）將離心管內(nèi)容物混勻，分別汲取4.4μL和110μL菌液于含有AMP的LB固體培育基上，用無(wú)菌的彎頭玻璃棒輕輕將細(xì)胞平均涂開(kāi)，將平板置于室溫下直到液體被汲取，倒置平板，在37℃過(guò)夜培育，而后經(jīng)過(guò)菌落數(shù)計(jì)算效價(jià)。2、電轉(zhuǎn)變:1）取電轉(zhuǎn)變感覺(jué)態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，,標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒也置于冰上，同時(shí)準(zhǔn)備干凈的電擊杯于冰上預(yù)冷。2）在含有40μl感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的0.5ml離心管中加入1μL稀釋十倍的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，充分混勻。而后轉(zhuǎn)移到電擊杯中，把電擊杯放在電擊儀長(zhǎng)進(jìn)行電擊（2500V，5ms）。3）在電擊杯中加入160μL無(wú)菌LB培育液（無(wú)抗生素），而后充分混勻，汲取于10ml離心管中，置于37℃恒溫振蕩器中培育45～60min.4）分別取2μL和50μL涂板，涂板操作同化學(xué)轉(zhuǎn)變。5）平板放到37℃的恒溫培育箱過(guò)夜培育。第二天清早讀取兩個(gè)平板的菌落數(shù)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、電轉(zhuǎn)變感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的效價(jià)：涂2μL菌液的平板上菌落數(shù)為88個(gè)，經(jīng)過(guò)計(jì)算知道，電轉(zhuǎn)變感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的效價(jià)為8.8×108。2、化學(xué)轉(zhuǎn)變感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的效價(jià)：無(wú)菌落生成，同組的也沒(méi)有出來(lái)結(jié)果。五、談?wù)?、感覺(jué)態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)變中的影響要素①細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培育菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久時(shí)為好，可經(jīng)過(guò)監(jiān)測(cè)培育液的OD600來(lái)控制。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)變效率。②質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:用于轉(zhuǎn)變的質(zhì)粒DNA應(yīng)主若是超螺旋態(tài)DNA。轉(zhuǎn)變效率與外源DNA的濃度在必定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí),轉(zhuǎn)變效率就會(huì)降低。1ng的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒即可使50μl的感覺(jué)態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般狀況下,DNA溶液的體積不該超出感覺(jué)態(tài)細(xì)胞體積的5％。③試劑的質(zhì)量:所用的試劑,如CaCl2等均需是最高純度的，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。④防范雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,槍優(yōu)等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌辦理,全部的試劑都要滅菌,且注意防范被其他試劑、DNA酶或雜DNA所污染,不然均會(huì)影響轉(zhuǎn)變效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為此后的挑選、判定帶來(lái)不用要的麻煩。⑤整個(gè)操作均需在冰長(zhǎng)進(jìn)行，不可以走開(kāi)冰浴，不然細(xì)胞轉(zhuǎn)變率將會(huì)降低。2、效價(jià)檢測(cè)結(jié)果分析：