周四下午老師-遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)2二

細(xì)胞與遺傳實(shí)驗(yàn)王浩細(xì)胞與遺傳醫(yī)學(xué)系細(xì)胞一結(jié)果不同應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的影響及機(jī)制探討細(xì)胞實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞實(shí)驗(yàn)二5組細(xì)胞給予不同處理正常、缺糖損傷、藥物處理現(xiàn)象的觀察

（細(xì)胞存活情況的比較，形態(tài)學(xué)觀察）根據(jù)觀察到的現(xiàn)象設(shè)計(jì)隨后的實(shí)驗(yàn)

（機(jī)制相關(guān)的探討）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.不同的實(shí)驗(yàn)分組相同對(duì)照組（Control）

---正常培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)糖損傷組（Glucosedeprivation，GD）

---給予對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞無(wú)糖培養(yǎng)約24小時(shí)順鉑20umol/l處理組（DDP20umol/l）---對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞給予順鉑20umol/l處理24小時(shí)順鉑40umol/l處理組（DDP40umol/l）---對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞給予順鉑40umol/l處理24小時(shí)順鉑60umol/l處理組（DDP60umol/l）---對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞給予順鉑60umol/l處理24小時(shí)順鉑

是一種含鉑的抗癌藥物，即順式-二氯二氨合鉑，棕黃色粉末，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，對(duì)肉瘤、惡性上皮腫瘤、淋巴瘤及生殖細(xì)胞腫瘤都有治療功效。作用機(jī)理順鉑進(jìn)入體內(nèi)后，一個(gè)氯緩慢被水分子取代，形成[PtCl(H2O)(NH3)2]+，其中的水分子很容易脫離，從而鉑與DNA堿基一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生配位。然后另一個(gè)氯脫離，[2]

鉑與DNA單鏈內(nèi)兩點(diǎn)或雙鏈發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程，使之發(fā)生細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.檢測(cè)指標(biāo)（1）細(xì)胞活力檢測(cè)

（2）Giemsa染色（3）Hoechst33258染色cellviabilityassayWST-8檢測(cè)噻唑藍(lán)(四甲基偶氮唑鹽，MTT)可透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT(淡黃色)還原為難溶于水的藍(lán)紫色的Formazan（甲臜）結(jié)晶，沉積在細(xì)胞中。其形成量與活性呈正相關(guān)。該結(jié)晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在波長(zhǎng)492nm測(cè)定其光吸收值?？砷g接反映活細(xì)胞的數(shù)量變化。introduction

WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色水溶性的formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞損傷越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來(lái)溶解；而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。器材與試劑培養(yǎng)細(xì)胞(96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)酶標(biāo)儀、移液槍、槍頭等試劑：CCK8檢測(cè)試劑盒

DMEM培養(yǎng)液（高糖、無(wú)糖）

順鉑（DDP）5mg/mlCellCountingKit-8簡(jiǎn)稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)試劑盒。Cellviabilityassay接種5×104/ml細(xì)胞于96孔板，每孔200ul培養(yǎng)液；分為三組，每組五個(gè)平行孔；37oC、5%CO2培養(yǎng)24h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）

----此時(shí)屬正常培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基（10%DMEM）1、24h后，Control組繼續(xù)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2、24h后，無(wú)糖損傷組棄去培養(yǎng)液，隨后加入無(wú)糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（棄去或加入培養(yǎng)基時(shí)均應(yīng)小心）繼續(xù)培養(yǎng)------GD組3、24h后，DDP（順鉑）組棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為20umol/l，40umol/l，60umol/l的培養(yǎng)基4、吸棄原培養(yǎng)液，加含CCK8試劑（10ul）的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基110ul繼續(xù)培養(yǎng)5、37oC孵育1h~2h6、酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度7、計(jì)算并分析結(jié)果（統(tǒng)計(jì)分析）Cellviabilityassay(today)GiemsaandHoechst33258stainingGiemsaandHoechst33258staining

Cellmorphology姬姆薩(Giemsa)染液是天青色素，伊紅，次甲藍(lán)的混合液。Hoechst33258是藍(lán)色熒光染料Giemsastaining吉姆薩染色的原理嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)合，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。器材與試劑培養(yǎng)細(xì)胞于小蓋片(6cm培養(yǎng)皿內(nèi))光學(xué)顯微鏡、移液槍、槍頭、載玻片等試劑：DMEM培養(yǎng)液（高糖、無(wú)糖）

順鉑（DDP）5mg/ml甲醇（固定液）PBS（pH7.4）Giemsa工作液（臨用現(xiàn)配）

Giemsa原液：PBS＝1：9混合而成。接種6×104/ml細(xì)胞于6cm培養(yǎng)皿（8塊小玻片/皿），每皿4ml培養(yǎng)液；37oC、5%CO2培養(yǎng)24h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）

----此時(shí)屬正常培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基（10%DMEM）1、24h后，Control組繼續(xù)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（3ml/皿）2、24h后，無(wú)糖損傷組棄去培養(yǎng)液，隨后加入無(wú)糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（棄去或加入培養(yǎng)基時(shí)均應(yīng)小心）繼續(xù)培養(yǎng)（3ml/皿）------GD組3、24h后，DDP（順鉑）組棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為20umol/l，40umol/l，60umol/l的培養(yǎng)基（3ml/皿）GiemsastainingGiemsastaining(today)1.每皿棄原培養(yǎng)基2.PBS洗滌兩次，5min/次，1.5ml/皿3.甲醇固定10min，1.5ml/皿4.Giemsa染色10min，1.5ml/皿5.水洗3到4次，直至背景干凈6.夾取小玻片放置于干燥載玻片上，鏡下觀察GiemsastainingresultsApoptosiscells:細(xì)胞皺縮、圓化，胞膜膨出、出泡（blebbing），生成膜包裹的凋亡小體（apoptoticbodies）GiemsastainingresultsGiemsastainingresultsHoechststainingHoechst33258akindofblue-fluorescencedye在細(xì)胞中Hochest33258在AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合?；罴?xì)胞或固定細(xì)胞均可從溶液中攝取該染料。從而使細(xì)胞核著色。器材與試劑96孔板熒光顯微鏡、移液槍、槍頭、載玻片等試劑：DMEM培養(yǎng)液（高糖、無(wú)糖）

順鉑（DDP）5mg/ml甲醇（固定液）PBS（pH7.4）Hochest33258工作液

接種5×104/ml細(xì)胞于96孔板，每孔200ul培養(yǎng)液；37oC、5%CO2培養(yǎng)24h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）

----此時(shí)屬正常培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基（10%DMEM）1、24h后，Control組繼續(xù)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2、24h后，無(wú)糖損傷組棄去培養(yǎng)液，隨后加入無(wú)糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（棄去或加入培養(yǎng)基時(shí)均應(yīng)小心）繼續(xù)培養(yǎng)------GD組3、24h后，DDP（順鉑）組棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為20umol/l，40umol/l，60umol/l的培養(yǎng)基Hochest33258stainingHoechst33258staining(today)1.棄原培養(yǎng)基2.PBS洗滌兩次，5min/次，200ul/孔3.甲醇固定5-10min4.PBS洗滌三次，5min/次，200ul/孔5.Hoechst33258染色37oC25min，25ul/孔(置于抽屜中，避光)6.PBS洗滌3次，5min/次Hoechst33258stainingresultNucleusofapoptosiscells

胞核固縮、破碎

染色質(zhì)凝聚、邊集等Hoechst33258stainingresultHoechst33258stainingresultGi