大二下-微免實(shí)驗(yàn)孫子須

微生物學(xué)與免疫學(xué)試驗(yàn)（二）嚴(yán)沁

大吞噬實(shí)驗(yàn)（單核巨噬細(xì)胞對(duì)大顆粒異物的吞噬）小吞噬實(shí)驗(yàn)（中性粒細(xì)胞對(duì)小顆粒異物的吞噬）

1、天然免疫/固有免疫/非特異性免疫：①解剖學(xué)屏障結(jié)構(gòu)：皮膚、黏膜、胃酸……②固有免疫細(xì)胞：吞噬細(xì)胞、DC、NK細(xì)胞……③固有免疫分子：補(bǔ)體、細(xì)胞因子……2、獲得性免疫/適應(yīng)性免疫/特異性免疫:①T淋巴細(xì)胞——細(xì)胞免疫②B淋巴細(xì)胞——體液免疫免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)內(nèi)容示教/錄像：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、E花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)示教：沉淀反應(yīng)——單向瓊脂擴(kuò)散、火箭電泳、

雙向瓊脂擴(kuò)散操作：沉淀反應(yīng)——對(duì)流免疫電泳操作：凝集反應(yīng)——玻片凝集反應(yīng)一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

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示教、錄像有絲分裂原縮寫(xiě)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)T淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞植物血凝素PHA++-刀豆蛋白AConA++-葡萄球菌A蛋白SPA-+美洲商陸PWM+++檢測(cè)人外周血T淋巴細(xì)胞功能的體外試驗(yàn)。一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

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示教、錄像原理：利用人外周血T淋巴細(xì)胞表面的有絲分裂原受體與相應(yīng)絲裂原在體外結(jié)合后，可使細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，表現(xiàn)為體積增大、胞漿豐富、并能進(jìn)行有絲分裂。根據(jù)其轉(zhuǎn)化的程度和轉(zhuǎn)化率，可測(cè)定機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。正常人淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率約為70％。分型：（1）小淋巴細(xì)胞：核質(zhì)密、胞漿少、無(wú)核仁（2）過(guò)渡型：比小淋巴細(xì)胞略大、核質(zhì)略疏松，有核仁（3）淋巴母細(xì)胞：大4～5倍，核質(zhì)疏松，核仁1～3個(gè)，核周淡染的透明區(qū)，胞漿網(wǎng)狀可見(jiàn)空泡（4）分裂相：染色體型一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

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示教、錄像二、E花環(huán)形成試驗(yàn)

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示教、錄像檢測(cè)人類外周血T細(xì)胞數(shù)量的一種體外試驗(yàn)方法原理：利用人類T淋巴細(xì)胞表面具有綿羊紅細(xì)胞受體，可非特異性吸附綿羊紅細(xì)胞。顯微鏡下可見(jiàn)以T細(xì)胞為中心，周圍環(huán)繞綿羊紅細(xì)胞，形似花環(huán)，即為E花環(huán)。一個(gè)E花環(huán)形成細(xì)胞即為一個(gè)T細(xì)胞。正常人外周血中E花環(huán)形成細(xì)胞約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的60％～80％。血清學(xué)反應(yīng)

一、概念

血清學(xué)反應(yīng)（serologicreactions）是指相應(yīng)的抗原和抗體在體外進(jìn)行的結(jié)合反應(yīng)。由于抗體主要存在于血清中，進(jìn)行這類反應(yīng)時(shí)一般都要用含有抗體的血清作為實(shí)驗(yàn)材料，所以把體外的抗原、抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。

二、一般特點(diǎn)：特異性、可逆性、可見(jiàn)性

三、影響因素：濃度、比例、電解質(zhì)、

溫度、酸堿度

四、基本類型

（一）沉淀反應(yīng)：環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀、瓊脂擴(kuò)散、

免疫電泳

（二）凝集反應(yīng)：直接凝集反應(yīng)、間接凝集反應(yīng)

（三）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

（四）中和反應(yīng)

（五）免疫標(biāo)記技術(shù)

血清學(xué)反應(yīng)沉淀反應(yīng)（precipitationtest）

一、概念

可溶性抗原（如血清、毒素、細(xì)菌滲出液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，若二者比例適當(dāng)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物或沉淀線，稱為沉淀反應(yīng)。

二、重要的沉淀反應(yīng)試驗(yàn)

1、單向瓊脂擴(kuò)散

2、火箭電泳

3、雙向瓊脂擴(kuò)散

4、對(duì)流免疫電泳

}}定量定性單向瓊脂擴(kuò)散

（singleagardiffusion）

將一定量已知抗體混于瓊脂中，制板，在適當(dāng)位置打孔，將抗原加入孔中向四周自由擴(kuò)散，與板中抗體相遇，在比例合適處呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比。

單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種定量試驗(yàn)，主要用于測(cè)定血清各種Ig和補(bǔ)體成分的含量

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（rocketelectrophoresis）

將一定量已知抗體混于瓊脂中，制板，在板的一端打一排小孔，加入待檢樣品，置于陰極端進(jìn)行電泳?？乖谟緞?dòng)過(guò)程中，與抗體在比例合適部位形成錐形沉淀峰，狀如火箭，稱火箭電泳，又稱為單向定量免疫電泳。沉淀峰的高低與抗原的濃度成正比。

本法敏感度與單擴(kuò)相仿，但需時(shí)較短。

雙向瓊脂擴(kuò)散

（doubleagardiffusion）

在瓊脂板上打孔，抗原和抗體分別加到相應(yīng)孔中，二者自由向四周擴(kuò)散，在比例合適處形成沉淀線。若同時(shí)含有若干對(duì)抗原抗體系統(tǒng)，可出現(xiàn)多條沉淀線。

雙向瓊脂擴(kuò)散是一種定性試驗(yàn)，可用于分析和鑒定標(biāo)本中多種未知抗原成分，也可用已知抗原檢測(cè)未知抗體。雙向瓊脂擴(kuò)散

（doubleagardiffusion）三、對(duì)流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)

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操作一、原理：抗原抗體在一定的pH溶液中帶有電荷，在電場(chǎng)的作用下可發(fā)生定向移動(dòng)。將抗原抗體加入pH8.6的瓊脂凝膠中，抗體只帶有微弱的負(fù)電荷，而且它的分子量又較大，所以泳動(dòng)慢。更重要的是抗體分子受電滲作用影響較大，也就是說(shuō)電滲作用大于它本身的遷移率。在電泳時(shí)，抗體不但不能抵抗電滲用向正極移動(dòng)，反而向負(fù)極倒退。而一般抗原蛋白帶負(fù)電荷，將抗原置于負(fù)極，將抗體置于正極，電泳后則在兩孔之間相遇，并在比例適當(dāng)?shù)牟课恍纬扇庋劭梢?jiàn)的沉淀線。

二、操作1、材料瓊脂板1塊/2人，打孔器2個(gè)/組抗AFP血清——已知AbAFP陽(yáng)性血清——陽(yáng)性Ag對(duì)照陰性血清——陰性Ag待檢血清：標(biāo)本1——未知Ag

標(biāo)本2——未知Ag三、對(duì)流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)

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操作2、方法－＋AgAbAgAb>1.5cm>1.5cm陰性陽(yáng)性標(biāo)1陰性標(biāo)2陽(yáng)性1、制板：用吸管吸取溶化的瓊脂加于載玻片上，約3.5mm（已備）2、打孔：用金屬打孔器打兩排孔，Ag孔與Ab孔間距離為4~5mm3、加樣：將抗AFP血清加入Ab孔內(nèi)，將AFP陽(yáng)性血清、對(duì)照陰性血清、待檢血清1和2分別加入相應(yīng)Ag孔內(nèi)。（如圖所示）*注意：每孔約加入10ul，加樣時(shí)切勿溢出孔外！4、電泳：將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，Ag孔置陰極端，Ab孔置陽(yáng)極端。5、關(guān)閉電源，取出瓊脂板，觀察結(jié)果4mm4mm3、結(jié)果：在相應(yīng)Ag、Ab孔間可見(jiàn)白色沉淀線。*記錄觀察結(jié)果后，請(qǐng)將瓊脂板上瓊脂刮入固體垃圾盆，統(tǒng)一放入前面的瓷缸里！三、對(duì)流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)

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操作

凝集反應(yīng)（agglutinationtest）一、概念：

顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集小塊。參與凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。二、類型直接凝集反應(yīng)：顆粒性抗原+抗體玻片法：定性（操作）試管法：半定量間接凝集反應(yīng)：可溶性抗原/抗體+微球載體（與免疫無(wú)關(guān)）

顆粒性抗原+抗體/抗原{↓四、直接凝集反應(yīng)——玻片凝集

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操作材料：玻片1張/1人，1號(hào)、2號(hào)菌，抗痢疾桿菌診斷血清方法：取生理鹽水4-5環(huán)，加入血清4-5環(huán)，刮取少許菌苔混勻

輕搖玻片，1～2分鐘后觀察結(jié)果判定：出現(xiàn)乳白色凝集塊為陽(yáng)性反應(yīng)*玻片扔進(jìn)水池旁臺(tái)上的玻璃缸里！

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后泡手消毒！1號(hào)菌液＋診斷血清2號(hào)菌液＋診斷血清1、示教：作圖（淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、E花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)、單向瓊脂擴(kuò)散、雙向瓊脂擴(kuò)散、火箭電泳）2、操作：步驟、作圖、結(jié)果分析（對(duì)流免疫電泳、玻片凝集反