免疫標(biāo)記技術(shù)節(jié)酶免疫技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)節(jié)酶免疫技術(shù)第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日第十六章酶免疫技術(shù)第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日目錄

酶標(biāo)志物的制備

1

酶聯(lián)免疫吸附試驗

2其他酶免疫技術(shù)

3第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日前言

酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記抗原或抗體為主要試劑，檢測樣本中相應(yīng)的抗體或抗原。將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)酶標(biāo)志物的制備

一、常用的酶和底物標(biāo)記酶的條件：

1.活性高，純度高2.作用專一性強(qiáng)3.性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)4.測定方法簡便易行、敏感、精確5.酶和底物對人體無害且價廉易得第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值越大純度越高RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要

ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶

常用酶第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種。H2O2為受氫體，不穩(wěn)定，需在用前臨時配置。第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.堿性磷酸酶

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌中提取。ALP底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、制備酶標(biāo)記抗體(抗原）的方法制備酶標(biāo)記物的方法應(yīng)符合簡單、產(chǎn)量高，避免酶、抗體（抗原）、酶標(biāo)記物各自形成聚合物，標(biāo)記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則。

主要方法：戊二醛交聯(lián)法

改良過碘酸鈉法

第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、酶標(biāo)記物的純化與鑒定純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。常用的是凝膠層析法和硫酸銨鹽析法，硫酸銨鹽析法操作簡便。酶標(biāo)記物的鑒定主要有：1、酶活性和抗體（抗原）免疫活性的鑒定

2、酶標(biāo)記率的測定

第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、固相載體（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體或抗原的容量大；②與抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定且不易脫落；③不影響所固定的抗體或抗原的活性；④固化方法應(yīng)簡便、快速。

第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應(yīng)板、小試管和小珠三種。2．微粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。

3.膜載體是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜等。第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗一、ELISA的檢測原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度，對標(biāo)本中抗原或抗體進(jìn)行定性或定量。第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、ELISA的方法類型（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，適用于檢測含有至少兩個抗原決定簇的較大分子抗原的測定。第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日如果血清標(biāo)本中含有類風(fēng)濕因子（RF），則可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因為類風(fēng)濕因子是一種抗變性IgG的自身抗體，它可同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體的Fc段發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。

第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）雙位點一步法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日

EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測定。第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日（三）間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（亦稱為酶標(biāo)二抗）來檢測已與固相結(jié)合的待測抗體。第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日此法由于受血清中高濃度非特異性IgG的干擾，通常要將待測標(biāo)本進(jìn)行一定稀釋后才能測定。第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日（四）競爭法競爭法既可用于檢測抗原，也可用于檢測抗體。第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日待測抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與待測抗原的量呈反比，待測抗原越多，其結(jié)合特異性抗體越多，而酶標(biāo)抗原與特異性抗體結(jié)合就減少，底物顯色反應(yīng)淺；顯色越深，待測抗原量則越少。競爭法測抗原第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日酶標(biāo)抗原

EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日競爭法主要用于檢測小分子抗原，因小分子抗原只有一個抗原決定簇

。第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日競爭法檢測抗體HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區(qū)別。第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.競爭法檢測HBcAb：先將HBcAg包被在固相載體上，形成固相抗原，之后加入待測樣本和酶標(biāo)的特異抗體，待測樣本的抗體將與酶標(biāo)抗體競爭與固相載體上的特異抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶底物顯色，顯色的強(qiáng)弱與待測抗體的含量成反比

。第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.競爭法檢測HBeAb：先將HBeAb包被在固相載體上，形成固相抗體，同時加入待測樣本和中和抗原HBeAg，待測樣本的抗體將與固相抗體競爭與中和抗原HBeAg結(jié)合。加入酶標(biāo)的特異抗體，再加入酶底物，則顯色的強(qiáng)弱與待測樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比。第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體EE底物E競爭法檢測HBeAb第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日

(五)捕獲法固相載體上連接的是IgM的第二抗體，先將標(biāo)本中的IgM類抗體捕獲，然后再分別加入特異抗原和酶標(biāo)抗體（動物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特異抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，復(fù)合物含量與待測IgM成正相關(guān)。最后加入底物，依據(jù)顯色程度來確定待測血清中IgM的含量。

第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE捕獲法檢測lgM抗體第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日在應(yīng)用此法時需注意RF(IgM類)及其他非特異IgM的干擾。RF(IgM類)既能與固相載體上的IgM第二抗體結(jié)合，又能與隨后加入的酶標(biāo)抗體結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日(六)雙抗原夾心法將已知抗原包被在固相載體上，待測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原的復(fù)合物，加入底物后依據(jù)顯色程度來確定待測抗體的含量。

第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日E固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、ELISA的關(guān)鍵技術(shù)（一）各種試劑的制備1．抗原和抗體2．包被與封閉

包被(coating)是將抗原或抗體固定在固相載體上的過程。封閉(blocking)就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。

3．酶標(biāo)結(jié)合物的制備

第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）最適工作濃度的選擇各類血清抗原稀釋度1：501：1001：2001：4001：800強(qiáng)陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.060.05稀釋液0..080.020.020.020.04間接法測抗體中包被抗原最適工作濃度的選擇

第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日（三）測定方法的標(biāo)準(zhǔn)化

1．加樣應(yīng)力求準(zhǔn)確，并注意不可產(chǎn)生氣泡。2．溫育注意反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致。3．洗滌

洗滌有手工洗滌和洗板機(jī)洗滌兩種方法，若用洗板機(jī)洗滌要適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。4．顯色要控制好顯色時間。第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、評價與應(yīng)用

評價ELISA的方法具有高度的特異性和靈敏度，操作方便快速，試劑穩(wěn)定，對環(huán)境無污染，儀器、設(shè)備要求簡單，實驗結(jié)果既可以用肉眼觀察作定性分析，也可以用酶標(biāo)儀進(jìn)行定性、定量分析，已經(jīng)成為臨床免疫檢驗中的常用技術(shù)。第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

應(yīng)用1.病原微生物測定2.激素測定3.藥物測定4.腫瘤標(biāo)志物5.蛋白質(zhì)測定第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日第三節(jié)其他酶免疫技術(shù)一、均相酶免疫技術(shù)

（一）酶擴(kuò)大免疫分析技術(shù)（二）克隆酶供體免疫分析第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日酶擴(kuò)大免疫分析技術(shù)示意圖第四十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日克隆酶供體免疫分析示意圖第四十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

液相酶免疫技術(shù)是非均相酶免疫技術(shù)的方法類型之一，因抗原抗體反應(yīng)在液相中進(jìn)行而得名。其依據(jù)樣品抗原加樣順序和溫育反應(yīng)時相不同可分為平衡法和非平衡法兩種類型。

二、液相酶免疫技術(shù)第四十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、斑點酶免疫吸附試驗屬于ELISA的一種類型，與前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白質(zhì)能力很強(qiáng)的硝酸纖維素膜（NC膜）代替了聚苯乙烯反應(yīng)板來作為固相載體，酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。

第四十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日第五十頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、斑點酶免疫滲濾試驗是將NC膜封于塑料小盒中，先在塑料小盒NC膜中滴加已知抗體，干燥后封閉，再依次加入待測標(biāo)本、酶標(biāo)抗體，最后加入底物，陽性時可在膜上出現(xiàn)有色斑點。

第五十一頁，