免疫組織化學技術(shù)

免疫組織化學技術(shù)第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十二章

免疫組織化學技術(shù)歐啟水第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日目錄第一節(jié)酶免疫組織化學技術(shù)第二節(jié)熒光免疫組織化學技術(shù)第三節(jié)親和組織化學技術(shù)第四節(jié)免疫標記電鏡技術(shù)第五節(jié)免疫組織化學技術(shù)的臨床應(yīng)用第六節(jié)影響免疫組織化學技術(shù)的主要因素第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日免疫組織化學技術(shù)（immunohistochemistrytechnique）又稱免疫細胞化學技術(shù)，是指用標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項免疫檢測方法。第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日根據(jù)標記物的不同，免疫組織化學技術(shù)可分為：酶免疫組織化學技術(shù)熒光免疫組織化學技術(shù)免疫金（銀）組織化學技術(shù)親和組織化學技術(shù)免疫標記電鏡組織化學技術(shù)第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日免疫組織化學的基本過程包括：抗原的提取與純化免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化將標記物與抗體結(jié)合形成標記抗體標本的處理與制備抗原抗體免疫學反應(yīng)以及標記物呈色反應(yīng)觀察結(jié)果第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)酶免疫組織化學技術(shù)第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日定義：在一定條件下，應(yīng)用酶標抗體（抗原）與組織或細胞標本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過顯微鏡觀察標本中抗原（抗體)的分布位置和性質(zhì)，也可通過圖像分析技術(shù)達到定量的目的。標本類型：有組織切片、組織印片和細胞涂片等。酶免疫組化技術(shù)可分為酶標記抗體免疫組化技術(shù)和非標記抗體酶免疫組化技術(shù)兩種類型。第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日直接法：將酶直接標記在特異性抗體上，與組織細胞內(nèi)相應(yīng)的抗原進行特異性反應(yīng)，形成抗原-抗體-酶復合物，最后用酶底物顯色。間接法：將酶標記在第二抗體上，先將第一抗體（特異性抗體）與相應(yīng)的組織抗原結(jié)合，形成抗原抗體復合物，再用第二抗體（酶標記的抗體）與復合物中的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，最后用底物顯色劑顯色。酶標記抗體免疫組織化學染色第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日直接法間接法優(yōu)點操作簡便特異性強檢測敏感性高制備一種酶標二抗可用于檢測多種抗原或抗體缺點敏感性低制備的抗體種類有限特異性不如直接法操作較為繁瑣酶標記抗體免疫組織化學染色比較第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日酶橋法：抗酶抗體作為第三抗體，通過橋抗體（第二抗體），將特異性識別組織抗原的第一抗體與第三抗體連接起來，形成酶聯(lián)的抗原-抗體復合物，加底物顯色（圖12-1）。非標記抗體酶免疫組織化學染色第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日酶橋法圖12-1酶免疫組織化學（酶橋法）原理示意圖第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）法：是在酶橋法基礎(chǔ)上加以改良。PAP法首先將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶組成可溶性復合物（PAP復合物，圖12-2）。該復合物由2個抗酶抗體和3個過氧化物酶分子組成，呈五角形結(jié)構(gòu)，非常穩(wěn)定。通過橋抗體（第二抗體），將特異性識別組織抗原的第一抗體與PAP復合物的抗酶抗體連接起來，此時要求特異性第一抗體與第三抗體的動物種屬相同（圖12-3）。非標記抗體酶免疫組織化學染色第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日PAP法圖12-2PAP復合物圖12-3酶免疫組織化學（PAP法）原理示意圖第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日雙橋PAP法：該法建立在PAP法的基礎(chǔ)上。其基本原理是在PAP法中通過兩次連接橋抗體和PAP復合物而建立起來的，通過雙橋可結(jié)合更多的PAP復合物于抗原分子上，以增強敏感性。堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（APAAP）法：用堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)—抗堿性磷酸酶(AAP)法，即簡稱APAAP。其技術(shù)要點與PAP法相似。非標記抗體酶免疫組織化學染色第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日酶免疫組織化學染色中的常用酶及顯色底物：酶底物顏色辣根過氧化物酶（HRP）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）橘紅色4-氯-1-萘酚灰藍色堿性磷酸酶（AP）α-萘酚磷酸鹽+快藍深藍色α-萘酚磷酸鹽+快紅紅色溴氯羥吲哚磷酸鹽（BCIP）+氮藍四唑（NBT）紫藍色第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)熒光免疫組織化學技術(shù)第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日采用熒光素標記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，可以分辨出抗原（或抗體）所在位置及性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計算其含量，以實現(xiàn)抗原（或抗體）定位、定性和定量測定的目的。定義第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日標本類型：涂片和印片組織切片：冷凍切片；石蠟切片細胞培養(yǎng)標本活細胞染色標本的保存：標本在固定干燥后，最好立即進行熒光抗體染色及鏡檢。如必須保存時，則應(yīng)保持干燥，置4℃以下保存。但病毒和某些組織抗原標本抗原性喪失很快，數(shù)天后就失去其抗原性，需在-20℃以下保存。組織處理第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日常用于熒光免疫組織化學技術(shù)的熒光素包括異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,

FITC）、藻紅蛋白（phycoerythrin,PE）等。熒光抗體的標記及純化詳見第四章。根據(jù)染色方法的不同，熒光免疫組織化學技術(shù)可區(qū)分為直接法和間接法。熒光抗體染色的結(jié)果一般用“-”或“+”表示。染色及結(jié)果判讀詳見第八章。熒光抗體的標記及染色第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)親和組織化學技術(shù)第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日一些具有雙價或多價結(jié)合力的物質(zhì)如植物凝集素(lectin)、生物素（biotin）和葡萄球菌A蛋白（staphylococcalprotein，SPA）等，對某種組織成分具有高親和力的特點，可以與標記物如熒光素、酶、同位素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)、放射自顯影或電子顯微鏡，在細胞或亞細胞水平進行對應(yīng)親和物質(zhì)的定位、定性或定量分析。定義第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日生物素-親合素法葡萄球菌蛋白A法凝集素法鏈霉親合素-生物素法親和組織化學技術(shù)第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日親合素-生物素-過氧化酶復合物技術(shù)(avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，ABC)

：按一定比例將親合素與酶標生物素結(jié)合．形成可溶性親合素-生物素－過氧化物酶復合物（ABC）。當其與檢測反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法，圖12-4）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時，ABC中末飽和的親合素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原抗體反應(yīng)體系與ABC標記體系連成一體進行檢測。生物素-親合素法第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日ABC直接法圖12-4親和組織化學（ABC直接法）原理示意圖第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日橋聯(lián)親合素-生物素技術(shù)(bridgedavidin-biotintechnique，BRAB)：該技術(shù)不同于ABC法，是以游離的親合素作為橋聯(lián)劑，利用親合素的多價性，將檢測反應(yīng)體系中抗原、生物素化抗體復合物與標記生物素（如酶標生物素）聯(lián)結(jié)起來，達到檢測反應(yīng)分子的目的。生物素-親合素法第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日標記生物素-抗生物素技術(shù)(labelledavidin-biotintechnique，LAB)：以標記親合素直接與免疫復合物中的生物素化抗體連接進行檢測。該法具有相當高的靈敏度，由于省略了加標記生物素步驟，操作較BRAB法簡便。間接LAB法采用的是生物素化的第二抗體，可以進一步提高檢測靈敏度。生物素-親合素法第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日根據(jù)SPA能與多種動物IgG的Fc段結(jié)合的原理，用SPA標記物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫檢測實驗。SPA具有和人及多種動物如豚鼠、兔、豬、犬、小鼠、猴等IgG結(jié)合的能力，可解決不同動物樣本檢測時，需分別標記相對應(yīng)的二抗的問題。SPA結(jié)合部位是Fc段，這種結(jié)合不會影響抗體的活性。葡萄球菌蛋白A法

第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日凝集素（lectin）可采用直接法和間接法進行細胞化學染色。直接法：將標記物直接結(jié)合在凝集素上，使其與組織細胞相應(yīng)的糖蛋白或糖脂相結(jié)合。間接法：先將凝集素與組織細胞膜糖基結(jié)合，然后再用標記的抗凝集素抗體（即用凝集素免疫動物制備抗凝集素抗體）與結(jié)合在細胞上的凝集素反應(yīng)。凝集素法

第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日鏈霉親合素(streptavidin，SA)是從鏈霉菌培養(yǎng)物提取的一種純蛋白，不含糖基，有4個生物素結(jié)合位點，并且具有高度的親和力，其功能類似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標記的鏈霉親和素蛋白就構(gòu)成了酶標鏈霉親合素-生物素方法(labelledstreptavidinbiotintechnique，LSAB)。鏈霉親合素-生物素法

第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日第四節(jié)免疫標記電鏡技術(shù)

第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日利用高電子密度的顆粒性標記物（如膠體金、鐵蛋白等）標記抗體，或用經(jīng)免疫組織/細胞化學反應(yīng)能產(chǎn)生高電子密度產(chǎn)物者如HRP標記抗體，在電子顯微鏡下對抗原抗體反應(yīng)中的高電子密度標記的抗原（抗體）進行亞細胞水平定位的技術(shù)。相較于其他免疫組織化學技術(shù)是在光鏡下進行抗原定位，免疫標記電鏡技術(shù)在電子顯微鏡下的定位更為精確，可定位至細胞膜、細胞器，在探索病因、發(fā)病機制、組織發(fā)生等方面有其獨特的優(yōu)點。原理

第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日在組織固定與取材時選用固定劑不宜過強，在取材方面，免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫化學技術(shù)要求更迅速、更精細。在免疫染色方面，又分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片染色三種。免疫標記電鏡技術(shù)標本制備要求

第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日免疫膠體金染色法免疫膠體鐵細胞化學染色法酶免疫電鏡技術(shù)常用的免疫標記電鏡技術(shù)

第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日第五節(jié)免疫組織化學技術(shù)的臨床應(yīng)用

第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日熒光免疫組織化學技術(shù)的應(yīng)用：1.在自身免疫性疾病中的應(yīng)用2.細菌和病毒的快速鑒定3.寄生蟲的檢測與研究酶免疫組織化學技術(shù)的應(yīng)用：1.提高病理診斷準確性2.癌基因蛋白的臨床應(yīng)用3.對腫瘤細胞增生程度的評價4.發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶5.在腫瘤分期上的意義6.指導腫瘤的治療免疫組織化學技術(shù)的臨床應(yīng)用

第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日（一）熒光激活細胞分類儀（FACS）（二）共聚焦顯微鏡技術(shù)（三）免疫組織化學—顯微切割技術(shù)免疫組織化學技術(shù)的拓展

第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日第六節(jié)影響免疫組織化學技術(shù)的主要因素

第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日標本的處理

標本的主要來源各種體液及穿刺液活體組織培養(yǎng)細胞第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日標本固定的目的：使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，細胞內(nèi)分解酶反應(yīng)終止，以防止細胞自溶，保持細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。保存組織細胞抗原性。防止標本脫落。除去妨礙抗體結(jié)合的類脂，便于保存。抑制組織中細菌的繁殖，防止組織腐敗和在后續(xù)組織制備中的細胞結(jié)構(gòu)和成分的改變。標本的固定與保存

第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日固定劑的選擇:蛋白質(zhì)類抗原，可用乙醇或甲醇固定。微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定。如需除去病毒的蛋白質(zhì)外殼，可使用胰蛋白酶。多糖類抗原用10%福爾馬林固定或以微火加熱固定。如有粘液物質(zhì)存在，應(yīng)用透明質(zhì)酸酶等處理除去。類脂質(zhì)豐富的組織進行蛋白、多糖抗原檢測時，需用有機溶劑（乙醚、丙酮等）處理除去類脂。標本的固定與保存

第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日制片方法的評價：冰凍和石蠟切片是免疫組化最常用的制片方法。為了使抗原達到最大限度的保存，首選的制片方法是冰凍切片。其操作簡便，可避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等對抗原所造成的損失，適用于不穩(wěn)定的抗原。石蠟切片是研究形態(tài)學的主要制片方法，它不但是觀察組織細胞結(jié)構(gòu)的理想方法，而且可用在陳舊石蠟包埋材料免疫組化的回顧性研究。切片薄而有連續(xù)性，可長期保存，但對抗原的保存不如冰凍切片。標本的固定與保存

第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日抗原的保存與修復

酶消化法

常用的抗原暴露、修復方法

鹽酸水解法

微波法

高壓鍋法煮沸法第四十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日抗體的選擇：應(yīng)注意選擇具有高度特異和穩(wěn)定的抗體，根據(jù)需要決定采用單克隆或多克隆抗體?？贵w的稀釋：抗原抗體反應(yīng)要求有合適的比例，過量或不足均不能達到預期結(jié)果。抗體的保存：在保存抗體時，要特別注意保持抗體的生物活性，防止抗體蛋白質(zhì)變性。抗體的處理與保存

第四十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日對照的設(shè)立：陽性對照。陰性對照。其他：空白、替代、吸收或阻斷