免疫細(xì)胞化學(xué)

免疫細(xì)胞化學(xué)第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日什么是細(xì)胞化學(xué)？檢測和分析細(xì)胞的化學(xué)組成？細(xì)胞打碎，化學(xué)成分釋放。不是細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日什么是細(xì)胞化學(xué)？在原位檢測和分析細(xì)胞的化學(xué)組成,保持原有結(jié)構(gòu)和位置第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的條件下，借助細(xì)胞中的化學(xué)反應(yīng)在原位確定化學(xué)成分的分布及這些成分的分布在細(xì)胞活動(dòng)中的動(dòng)態(tài)變化的技術(shù)，用以闡明細(xì)胞化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。包括酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、放射自顯影技術(shù)和原位雜交等。第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；2.防止細(xì)胞的自溶，以免使抗原擴(kuò)散至組織間質(zhì)；3.細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固;4.保持組織或細(xì)胞化學(xué)成分的某些屬性,如抗原性或核酸雜交活性。固定（Fixation)特點(diǎn)1.原位：怎樣做到組織/細(xì)胞的原位？方法：固定劑Ⅰ類：醛類，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。

Ⅱ類：氧化劑類，四氧化鋨（奧酸），高錳酸鉀，重鉻酸鉀等。

Ⅲ類：蛋白變性類，甲醇，乙醇，醋酸等。

Ⅳ類：其他，氯化汞，苦味酸等。

根據(jù)組織類型，選擇合適的固定劑

第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日特點(diǎn)2.細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)及可見性酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原位雜交技術(shù)放射自顯影酶+底物反應(yīng)顯色反應(yīng)抗原+抗體反應(yīng)顯色反應(yīng)放射性同位素衰變和射線的釋放反應(yīng)感光核酸雜交反應(yīng)顯色反應(yīng)第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日

細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要包括：

酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)放射自顯影原位雜交技術(shù)等第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日定性、定位分析定量分析特點(diǎn)3.細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的觀察顯微鏡流式第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日石蠟包埋或冷凍切片（保持原位）組織細(xì)胞固定化學(xué)反應(yīng)顯色反應(yīng)

細(xì)胞化學(xué)技術(shù)通用流程第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日3.技術(shù)的靈敏度和特異性、問題的解決（troubleshooting)靈敏度(Sensitivity):是否有信號特異性(Specificity)：信號是否特異2.技術(shù)的基本原理1.技術(shù)的適用范圍學(xué)習(xí)和應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)技術(shù)應(yīng)注意的方面第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日

細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要包括：

酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)放射自顯影原位雜交技術(shù)等第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

是利用免疫化學(xué)反應(yīng)來定位組織細(xì)胞中特異大分子的一類技術(shù)。Immunocytochemistry免疫組織化學(xué)（免疫組化)immunohistochemistry第十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.組織細(xì)胞中的特異分子均可作為抗原,因而該技術(shù)可用來檢測幾乎所有大分子的定位。應(yīng)用范圍：2.也可用在其他細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的顯示反應(yīng)中。第十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日

一、抗原

二、抗體

三、免疫反應(yīng)的特異性

四、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)

五、標(biāo)記物及其在光鏡和電鏡下可見性第一節(jié)免疫細(xì)胞化學(xué)原理第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體特異結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原。

一、抗原

細(xì)胞中具有抗原性的化學(xué)成分有：

蛋白質(zhì)多肽脂蛋白多糖脂多糖糖蛋白核蛋白

這些生物大分子都能用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測嗎?

從生物學(xué)功能來看都包括了哪些物質(zhì)?第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日

酶、受體、抗體、細(xì)胞外基質(zhì)激素、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、病原體等它們都可以用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)來檢測第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日

二、抗體CC*Fab片段：結(jié)合抗原決定與抗原結(jié)合的特異性（抗體活性）

*Fc片段：結(jié)合抗種屬抗體同種型抗原性的抗原決定簇，（“抗原性”活性）

（如:來源于兔的抗體，可被抗兔抗體識別和結(jié)合）FcFab2種“結(jié)合力”第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日識別一抗的種屬特異性，并能夠因此結(jié)合一抗,稱為二抗(抗種屬抗體)。二抗(secondaryantibody)一抗(primaryantibody)

抗原(antigen)

識別特異抗原“一抗、二抗”第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

2類抗體

多克隆抗體—

抗血清，是用提純的抗原免疫動(dòng)物后從動(dòng)物血清制備得到的。特點(diǎn)：可自行制備；靈敏度高；特異性？

單克隆抗體—

由單個(gè)產(chǎn)生特異抗體的Ｂ淋巴細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體。特點(diǎn)：特異性高

兼顧靈敏度，特異性第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫反應(yīng)的特異性表現(xiàn)在：抗原作為一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子能刺激機(jī)體產(chǎn)生對其特異的抗體并與抗體發(fā)生反應(yīng)

抗體針對某種抗原分子而產(chǎn)生，特異地識別該抗原并與其結(jié)合三、免疫反應(yīng)的特異性

第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

把組織細(xì)胞中的特異分子作為抗原,用在顯微鏡下可見的標(biāo)記物標(biāo)記特異抗體(或者標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物)結(jié)合，使免疫化學(xué)反應(yīng)具有可見性,間接地顯示抗原,達(dá)到在細(xì)胞或細(xì)胞器水平定位特異分子的目的。

四、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日組織抗原

免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)原理＋標(biāo)記抗體標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物免疫反應(yīng)顯色反應(yīng)第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

直接法直接標(biāo)記第一抗體

兩種方法：直接法和間接法

間接法標(biāo)記第二抗體或復(fù)合物第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日直接法與間接法

直接法

組織抗原直接與標(biāo)記的特異抗體（一抗）反應(yīng)間接法

組織抗原與未標(biāo)記的特異抗體（一抗）反應(yīng)一抗再作為抗原與標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)★不必對一抗作標(biāo)記★

標(biāo)記物多★避免標(biāo)記造成對抗體與抗原結(jié)合的影響

★信號增強(qiáng)第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日五、標(biāo)記物及其在光鏡和電鏡下的可見性

標(biāo)記物

使抗體或抗原抗體復(fù)合物在各種顯微鏡下可見的物質(zhì)1.熒光2.酶3.親和物質(zhì)4.膠體金顆粒第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日

1.免疫熒光技術(shù)

2.免疫酶技術(shù)

3.免疫親和技術(shù)

4.免疫膠體金技術(shù)1.熒光2.酶3.親和物質(zhì)4.膠體金顆粒根據(jù)標(biāo)記物，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為：第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日

免疫熒光技術(shù)將熒光素作為標(biāo)記物使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質(zhì)的定位

（一）免疫熒光技術(shù)第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

熒光素：

在激發(fā)光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長更長的可見光（發(fā)射光），在顯微鏡下可見，并隨照射停止而消失。

熒光顯微鏡：

熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出發(fā)射光.（應(yīng)用熒光染料時(shí)都需要知道2個(gè)波長：excitationwavelength,emissionwavelength)第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日

如:１.異硫氰酸熒光素(

FITC)

ex:490nm,es:520-530綠色

２.四乙基羅達(dá)明

ex:570nm,es:595nm明亮的橙色３.四甲基異硫氰酸羅達(dá)明ex:550nm,es:620nm橙紅色４.藻紅蛋白(PE)

多種，橙黃-紅色

熒光素

第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日海馬細(xì)胞

微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)

黃色？共定位第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日原代培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞檢測細(xì)胞連接及細(xì)胞黏附(黏附相關(guān)蛋白質(zhì)-FITC）第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日補(bǔ)充:熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)技術(shù):

近年大量用于表達(dá)重組蛋白的培養(yǎng)細(xì)胞，作為外源性蛋白質(zhì)表達(dá)的標(biāo)記，可用于考察亞細(xì)胞定位subcellularlocalization多分子共定位co-localization第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日subcellularlocalization帶標(biāo)簽的重組蛋白RecombinantproteinRFP-tagGFP-tagco-localizationProtein1.Protein2.mRFP-H2BGFP-B23GFP-SENP3RFP-B23ByYangKai,unpublisheddata第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.雙重或多重標(biāo)記，同時(shí)比較不同分子的位置及量的關(guān)系。2.雙重或多重標(biāo)記，同時(shí)染色細(xì)胞器和感興趣分子，可顯示分子的亞細(xì)胞定位信息。3.根據(jù)熒光素的強(qiáng)度，進(jìn)行半定量分析免疫熒光技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：DAPI蛋白1shRNA-蛋白B載體與EGFP融合merge第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日

是將酶作為標(biāo)記物使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物得到標(biāo)記，再通過酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顯微鏡下可見的顯色物質(zhì)，間接顯示抗原物質(zhì)的定位.普通光學(xué)顯微鏡即可觀察

（二）免疫酶技術(shù)第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日酶抗原一抗二抗酶標(biāo)二抗酶—抗酶抗體復(fù)合物抗酶抗體第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日酶標(biāo)抗體法抗酶抗體法

復(fù)合物法酶標(biāo)記的三種形式：信號的放大一抗二抗抗酶抗體一抗二抗抗酶抗體復(fù)合物一抗二抗第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日常用的標(biāo)記酶：

辣根過氧化物酶

2.堿性磷酸酶外源的酶，與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源酶應(yīng)該有明顯區(qū)別.第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日

顯示辣根過氧化物酶（HRP)底物為DAB(二氨基聯(lián)苯胺)，經(jīng)一系列氧化聚合反應(yīng)后形成聚合物，在光鏡下呈棕黃色;DAB經(jīng)鋨酸固定后能生成具有鋨黑,電鏡下呈現(xiàn)高電子密度.

既適用于光鏡，又適用于電鏡。HRP

H2O2

H2O

nDAB鋨酸

鋨黑（高電子密度）DAB氧化聚合物(棕黃色)

第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日

a.底物：萘酚衍生物，捕捉底物：固紅或固藍(lán)產(chǎn)物：紅或藍(lán)色偶氮色素

AP底物紅或藍(lán)偶氮色素固紅或固藍(lán)

APBCIP藍(lán)紫色色素NBT

b.底物：吲哚酚酯，捕捉底物：四唑鹽，產(chǎn)物：藍(lán)紫色

顯示堿性磷酸酶(AP)

第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

（1）過氧化物酶標(biāo)記抗體法（2）過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）*一抗+組織抗原*二抗+第一抗體+PAP復(fù)合物*加入H2O2和DAB

光鏡-棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物(組織抗原的定位)１.辣根過氧化物酶（hoseradishperoxidase,HRP）一抗二抗PAP“橋梁”第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日J(rèn)MJD2B在結(jié)腸癌中的表達(dá)HRP標(biāo)記抗體正常組織腫瘤組織靈敏度：高特異性：好2.陽性程度有差異++：%+：%-：%結(jié)果判斷3.核質(zhì)分布有差異核+：%質(zhì)+：%1.正常/腫瘤有差異FuL,etal.Carcinogenesis,2012,33(9):1664第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

２.堿性磷酸酶（Alkalinephosphotase,AKP）兩種方法：

(1)堿性磷酸酶標(biāo)記抗體

(2)堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物法（APAAP）（Alkalinephosphotase－Antialkalinephosphotase）

第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.反應(yīng)后標(biāo)本材料可長期保存2.觀察定位信息時(shí)，可觀察感興趣分子在細(xì)胞整體中的相對定位，顏色對比清晰3.同時(shí)觀察陽性信號和陰性信號。3.能用于電鏡觀察4.可用于原位雜交技術(shù)的探測。免疫酶技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：與免疫熒光技術(shù)對比DAPI蛋白1EGFP/shRNAmerge第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日（三）免疫膠體金技術(shù)

以電鏡下都可見的膠體金作為抗體或蛋白Ａ的標(biāo)記物，間接顯示組織細(xì)胞中特異分子的技術(shù)。

通常在電鏡下觀察膠體金顆粒大小一般在5--60nm

金標(biāo)抗體或金標(biāo)A蛋白（二抗）

一抗+抗原第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日1、亞細(xì)胞定位（超微結(jié)構(gòu)定位）2、采用不同大小的金顆粒(通常5-20nm)，標(biāo)記不同抗體或A蛋白，達(dá)到雙重甚至多重標(biāo)記，定位多種抗原的目的

免疫膠體金技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：X蛋白定位于核仁第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日親和物質(zhì)

具有多價(jià)能力的物質(zhì)，與另一種親和物質(zhì)有高度親和力，又能與抗體、蛋白質(zhì)及各種標(biāo)記物(熒光素、酶、膠體金等)結(jié)合

最常用的親和物質(zhì)系統(tǒng)：

1、生物素（biotin）-親和素（avidin）結(jié)合能力強(qiáng)，結(jié)合不可逆

2、葡萄球菌A蛋白-免疫球蛋白IgG

（四）親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)通常在光鏡下觀察第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

(1)標(biāo)記親和素－生物素技術(shù)

（LabeledStreptoavidinbiotin,LSAB）

(2)橋式親和素－生物素技術(shù)（Bridgedavidinbiotin,BAB）

(3)親和素－生物素-酶復(fù)合物技術(shù)

（Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC）1.生物素系統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)的基本方法第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日生物素化酶生物素化抗體親和素—生物素

—酶復(fù)合物生物素親和素第五十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日

標(biāo)記鏈球菌親和素-生物素技術(shù)

Labeledstreptoavidinbiotin（LSAB)①→③→②→Hsp90在肝細(xì)胞中的表達(dá)(LSAB法)肝癌組織癌旁組織第五十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

親和素－生物素-酶復(fù)合物技術(shù)（ABC）

親和素-生物素-HRP①一抗③

復(fù)合物②二抗生物素化靈敏度：高特異性：好陽性程度有差異++：%+：%-：%結(jié)果判斷：抑癌基因產(chǎn)物P16位于垂體腺瘤細(xì)胞核第五十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日

葡萄球菌A蛋(StaphylocalproteinA,SPA)

◆是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁含有的一種蛋白簡稱為A蛋白或蛋白A

◆

SPA能與人及多種哺乳動(dòng)物血清中IgG呈非特異性結(jié)合又能與標(biāo)記物結(jié)合

經(jīng)標(biāo)記的SPA可代替相應(yīng)標(biāo)記的二抗2.葡萄球菌A蛋白與IgG系統(tǒng)第五十四頁，共五十八頁，2022年，8月2