第11章生物素親合素放大技術(shù)

會(huì)計(jì)學(xué)1第11章生物素親合素放大技術(shù)生物素（biotin,B）是一種小分子生長因子,又稱維生素H或輔酶R動(dòng)、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高M(jìn)W244.31kD.I環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合素結(jié)合Ⅱ環(huán)為噻吩環(huán)，C2上戊酸側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)

I咪唑酮環(huán)

Ⅱ噻吩環(huán)

羧基第一節(jié)生物素理化性質(zhì)與標(biāo)記第1頁/共49頁一、活化生物素生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶各種活性基團(tuán)的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)第2頁/共49頁生物素活化活化生物素易與抗原、抗體酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素標(biāo)記核酸的活化生物素第3頁/共49頁CNHNHCHCH2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素生物素N-羥基丁二酰胺碳二亞胺生物素羥基琥珀酰亞胺酯（BNHS）第4頁/共49頁活化生物素BNHS分子可與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基形成肽鍵BNHS適用標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì)如何減小空間位阻？長臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個(gè)6-氨基已糖分子基團(tuán)，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的距離第5頁/共49頁標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)

：生物素與賴氨酸連接后，再與無水肼反應(yīng)而成。除醛基外，BCHZ還可標(biāo)記氨基第6頁/共49頁標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素第7頁/共49頁標(biāo)記核酸的活化生物素光敏生物素(photobiotin)

側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán),經(jīng)光照后,變?yōu)榉枷慊趸?，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合,形成B-核酸探針

N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO第8頁/共49頁生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）

作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移位法摻入到雙鏈DNA中。BNHS和BHZ

可直接標(biāo)記核酸，但對(duì)堿基配對(duì)有影響。第9頁/共49頁活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接；一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記－多價(jià)性；對(duì)BNHS多標(biāo)記抗體,BHZ則多標(biāo)記微酸性抗原；抗原、抗體標(biāo)記后活性不變；可對(duì)標(biāo)記材料（如酶）標(biāo)記：堿性磷酸酶標(biāo)記后活性將降低；二、生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)第10頁/共49頁選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：蛋白質(zhì)比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1,IgG應(yīng)用濃度

0.5~5μg/ml;

生物素1~3個(gè)/Ag，3~5個(gè)/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力第11頁/共49頁第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

親合素(avidin,AV)和鏈霉親合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結(jié)合。第12頁/共49頁結(jié)構(gòu)

四亞基糖蛋白四肽鏈蛋白無糖基PI

10.56結(jié)合位

色氨酸色氨酸生物素

44Ka

10151015活性

13～1515～18親合素（A）鏈霉親合素(SA)一、理化特性第13頁/共49頁二、親合素/鏈霉親合素標(biāo)記標(biāo)記物：小分子示蹤物125I、膠體金、熒光素、化學(xué)發(fā)光物大分子物質(zhì)如酶抗原、抗體親和素的標(biāo)記：HRP的標(biāo)記改良過碘酸鈉法戊二醛法第14頁/共49頁過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2AvidinOOONNAvidinAvidinH2ONAvdinNaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)第15頁/共49頁戊二醛法酶－NH2親和素－NH2＋(CH2)3CHOCHO(CH2)3CHN酶CHN親和素第16頁/共49頁B-E+AABC2.親和素－生物素化HRP復(fù)合物的制備第17頁/共49頁鏈霉親和素的標(biāo)記方法：過碘酸鈉法HRP+NaIO4+SA透析+KBH4

沉淀第18頁/共49頁過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2SAvidinOOONNSAvidinSAvidinH2ONAvdinKBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)第19頁/共49頁第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)一、靈敏度高二、特異性強(qiáng)三、穩(wěn)定性好四、適用性廣五、其他第20頁/共49頁第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級(jí)放大作用等優(yōu)越性，使BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測(cè)自動(dòng)化分析做出了極大的貢獻(xiàn)。

第21頁/共49頁一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理BAB法：

Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E

特點(diǎn)：以游離A分別連接B-Ab和B-E第22頁/共49頁+A+A第23頁/共49頁ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特點(diǎn):將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC第24頁/共49頁++ABCB-E+AABCAb-Ag-Ab-B+ABCAb-Ag-Ab-B-ABC第25頁/共49頁BA法Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特點(diǎn)：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省卻了加B-E的步驟第26頁/共49頁

Ag-Ab1-Ab2-B+A-EAg-Ab1-Ab2-B-A-E+A-E第27頁/共49頁BAS實(shí)驗(yàn)方法及反應(yīng)層次方法反應(yīng)層次直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-AB*C間接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-AB*C第28頁/共49頁二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用BAS在ELISA中的應(yīng)用生物素-親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測(cè)定

第29頁/共49頁AB固相化抗原或抗體BY第30頁/共49頁電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖第31頁/共49頁用于終反應(yīng)的放大第32頁/共49頁三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS用于熒光抗體技術(shù)，通常采用BA法，即用熒光素直接標(biāo)記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標(biāo)記的生物素（BAB法）或熒光標(biāo)記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。

第33頁/共49頁四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測(cè)體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反應(yīng)后B、F成分的分離第34頁/共49頁五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用以生物素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行的定位檢測(cè)用BAS制備的親和吸附劑進(jìn)行基因的分離純化將免疫測(cè)定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測(cè)第35頁/共49頁Anti-HCVSandwichprinciple.Totalduration:18minutes.1stincubation:40μLofsample,60μLofreagentcontainingbiotinylatedHCVantigensand60μLofareagentcontainingHCVantigenslabeledwitharutheniumcomplexreacttoformasandwichcomplex.2ndincubation:Afteradditionofstrepetavidin-coatedmicroparticles,thecomplexbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiontinandstreptavidin.第36頁/共49頁Thereactionmixtureisaspiratedintothemeasuringcellwherethemicroparticlesaremagneticallycapturedontothesurfaceoftheelectrode.UnboundsubstancesarethenremovedwithProCell.Applicationofavoltagetotheelectrodetheninduceschemiluminescentemissionwhichismeasuredbyaphotomultiplier.ResultsaredeterminedautomaticallybytheElecsyssoftwarebycomparingtheelectrochemiluminescencesignalobtainedfromthesamplewiththecutoffvalueobtainedbyanti-HCVcalibration.第37頁/共49頁HBsAgIISandwichprinciple.Totaldurationofassay:18minutes.1stincubation:50μLofsample,twobiotinylatedmonoclonalanti-HBsAgantibodies,andamixtureofmonoclonalanti-HBsAgantibodyandpolyclonalanti-HBsAgantibodieslabeledwitharutheniumcomplexformasandwichcomplex.2nd:incubation:Afteradditionofstreptavidin-coatedmicroparticles,thecomplexbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavidin.第38頁/共49頁Anti-HBeCompetitionprinciple.1st:incubation:Anti-HBeinthesample(35μL)bindstotheaddedHBeAg.2ndincubation:Afteradditionofbiotinylatedantibodiesandrutheniumcomplex-labeledantibodiesspecificforHBeAg,togetherwithstreptavdin-coatedmicroparticles,thestill-freebindingsitesontheHBe-antigensbecomeoccupied.Theentirecomplexisthenboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavdin.第39頁/共49頁Anti-HAVIgMμ-Capturetestprinciple.Totaldurationofassay:18minutes.1stincubation:Pretreatmentof10μLoftheautomatically1:400dilutedsample(usingElecsysDiluentUniversal)withanti-Fdyreagenttoblockspecificinthepresenceofthemonoclonalanti-HAVantibodieslabeledwithrutheniumcomplex.第40頁/共49頁2ndincubation:Afteraddionofbiotinylatedmonoclonalh-IgM-specificantibodies,HAVantigen,andstreptavdin-coatedmicroparticles,theanti-HAVIgMantibodiespresentinthesampleformasandwichcomplexwiththeHAVantigenandtheruthenium-labeledanti-HAVantibodywhichbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavidin.第41頁/共49頁Anti-HBsSandwichprinciple.1stincubation:Anti-HBsinthesample(40L),biotinylatedHBsAg(ad/ay),andHBsAg(ad/ay)labeledwitharutheniumcomplexreacttoformasandwichcoplex.2ndincubation:Afteradditionofstrepavdin-coatedmicroparticles,thecomplesbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinan