免疫學(xué)技術(shù)概論

免疫學(xué)技術(shù)概論第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日[目的與要求]1、了解最新的免疫學(xué)診斷技術(shù)以及細(xì)胞免疫技術(shù)的種類與用途；

2、掌握常用的免疫血清學(xué)技術(shù)及其實(shí)驗(yàn)原理、影響因素；

3、掌握生物技術(shù)公司常用的免疫制備技術(shù)；

4、了解免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展趨向。[難點(diǎn)與重點(diǎn)]

重點(diǎn)：常用的免疫血清學(xué)技術(shù)及其實(shí)驗(yàn)原理、影響因素；生物技術(shù)公司常用的免疫制備技術(shù)。難點(diǎn)：常用的免疫血清學(xué)技術(shù)及其實(shí)驗(yàn)原理、影響因素。第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日

免疫學(xué)技術(shù)是指利用免疫反應(yīng)的特異性原理，建立各種檢測(cè)與分析技術(shù)以及建立這些技術(shù)的各種制備方法，包括：①用于抗原或抗體檢測(cè)的體外免疫反應(yīng)技術(shù)，或稱免疫檢測(cè)技術(shù)，這類技術(shù)一般都需要血清進(jìn)行試驗(yàn)，故又稱為免疫血清學(xué)反應(yīng)或免疫血清學(xué)技術(shù)；②用于研究機(jī)體細(xì)胞免疫功能與狀態(tài)的細(xì)胞免疫技術(shù)；③用于建立免疫檢測(cè)方法的免疫制備技術(shù)，如抗體或抗原的純化技術(shù)、抗體的標(biāo)記技術(shù)。第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日E-玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)正常人外周血中T細(xì)胞在體外能直接和綿羊紅細(xì)胞(SRBC)結(jié)合形成玫瑰花樣細(xì)胞團(tuán)。這是因?yàn)槿说腡細(xì)胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相結(jié)合的受體，稱為E受體。已證實(shí)E受體是人T細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志，因此本試驗(yàn)可作為人外周血T細(xì)胞的鑒定和計(jì)數(shù)，同時(shí)作為人細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，也是分離T細(xì)胞的常用方法之一。免疫標(biāo)記技術(shù)第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日第1節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)概述

抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)和體外均能發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，因抗體主要來自血清，因此在體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或免疫血清學(xué)技術(shù)，是建立在抗原抗體特異性反應(yīng)基礎(chǔ)上的檢測(cè)技術(shù)。免疫血清學(xué)技術(shù)自19世紀(jì)建立了最早和最簡(jiǎn)單的凝集試驗(yàn)開始，不斷發(fā)展，尤其是近20余年來，各種新方法、新技術(shù)層出不窮，應(yīng)用面也日益擴(kuò)大，已深入到生物學(xué)科的各個(gè)研究領(lǐng)域。第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日

免疫血清學(xué)技術(shù)按抗原抗體反應(yīng)性質(zhì)不同可分為凝聚性反應(yīng)(包括凝集試驗(yàn)和沉淀試驗(yàn))、標(biāo)記抗體技術(shù)(包括熒光抗體、酶標(biāo)抗體、放射性同位素標(biāo)記抗體、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記抗體技術(shù)等)、有補(bǔ)體參與的反應(yīng)(補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫黏附血凝試驗(yàn)等)、中和反應(yīng)(病毒中和試驗(yàn)等)等已普遍應(yīng)用的技術(shù)，以及免疫復(fù)合物散射反應(yīng)(激光散射免疫測(cè)定)、電免疫反應(yīng)(免疫傳感器技術(shù))、免疫轉(zhuǎn)印(westernb1otting)以及建立在抗原抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的免疫蛋白芯片技術(shù)等新技術(shù)。一、免疫血清學(xué)技術(shù)的類型第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日凝集試驗(yàn)（血球凝集）凝集試驗(yàn)（細(xì)菌凝集）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗原-抗體反應(yīng)模式圖第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)對(duì)流免疫電泳火箭免疫電泳第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、免疫血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)(一)特異性與交叉性血清學(xué)反應(yīng)具有高度特異性。這是血清學(xué)試驗(yàn)用于分析各種抗原和進(jìn)行疾病診斷的基礎(chǔ)。一般血緣越近，交叉反應(yīng)的程度也越高。除相互交叉反應(yīng)外，也有表現(xiàn)為單向交叉的，單向交叉在選擇疫苗用菌(毒)株時(shí)有重要意義。天花牛痘第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日(二)抗原與抗體結(jié)合機(jī)理

抗原和抗體的結(jié)合為弱能量的非共價(jià)鍵結(jié)合，其結(jié)合力決定于抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗原表位之間形成的非共價(jià)鍵的數(shù)量、性質(zhì)和距離，由此可分為高親和力、中親和力和低親和力抗體。

第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日(二)抗原與抗體結(jié)合機(jī)理

抗原與抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這一過程受物理、化學(xué)、熱力學(xué)的法則所制約，結(jié)合的溫度應(yīng)在0～40℃，pH在4～9。如溫度超過60℃或pH降到3以下時(shí)，則抗原抗體復(fù)合物又可重新解離。利用抗原抗體既能特異性地結(jié)合，又能在一定條件下重新分離這一特性，可進(jìn)行免疫親和層析，以制備免疫純的抗原或抗體。第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日

抗原與抗體在適宜的條件下就能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。但對(duì)于常規(guī)的血清學(xué)反應(yīng)，如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等，只有在抗原與抗體呈適當(dāng)比例時(shí)，結(jié)合反應(yīng)才出現(xiàn)凝集、沉淀等可見反應(yīng)結(jié)果，在最適比例時(shí)，反應(yīng)最明顯。這種因抗原過多或抗體過多而出現(xiàn)抑制可見反應(yīng)的現(xiàn)象，稱為帶(zone)現(xiàn)象。

(二)抗原與抗體結(jié)合機(jī)理

第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日

為了克服帶現(xiàn)象，在進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)時(shí)，需將抗原和抗體作適當(dāng)稀釋，通常是固定一種成分而稀釋另一種成分。為了選擇抗原和抗體的最適用量，也可同時(shí)遞進(jìn)稀釋抗原和抗體，用綜合變量法進(jìn)行方陣測(cè)定。(二)抗原與抗體結(jié)合機(jī)理

第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日(三)免疫血清學(xué)反應(yīng)的影響因素影響免疫血清學(xué)反應(yīng)的因素主要有電解質(zhì)、溫度、pH值等。1、電解質(zhì)特異性的抗原和抗體具有對(duì)應(yīng)的極性基(羧基、氨基等)，它們互相吸附后，其電荷和極性被中和因而失去親水性，變?yōu)樵魉到y(tǒng)。此時(shí)易受電解質(zhì)的作用失去電荷而互相凝聚、發(fā)生凝集或沉淀反應(yīng)。因此，需在適當(dāng)濃度的電解質(zhì)參與下，才出現(xiàn)可見反應(yīng)。故血清學(xué)反應(yīng)一般用生理鹽水作稀釋液，標(biāo)記抗體技術(shù)中，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)作稀釋液。第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日2、溫度在一定溫度下，將抗原抗體保溫一定時(shí)間，可促使兩個(gè)階段的反應(yīng)。較高的溫度可以增加抗原和抗體接觸的機(jī)會(huì)，從而加速反應(yīng)的出現(xiàn)。將抗原、抗體反應(yīng)通常在37℃(培養(yǎng)箱或水浴)，也可在室溫下進(jìn)行；亦可用56℃水浴反應(yīng)更快。有的抗原或抗體系統(tǒng)在低溫長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合反應(yīng)更充分，如有的補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)在冰箱低溫結(jié)合效果更好。(三)免疫血清學(xué)反應(yīng)的影響因素影響免疫血清學(xué)反應(yīng)的因素主要有電解質(zhì)、溫度、pH值等。第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日3、酸堿度血清學(xué)反應(yīng)常用pH為6～8，過高或過低的pH值可使抗原抗體復(fù)合物重新離解。如pH值降至抗原或抗體的等電點(diǎn)時(shí)，可引起非特異性的酸凝集，造成假象，出現(xiàn)假陽性。(三)免疫血清學(xué)反應(yīng)的影響因素影響免疫血清學(xué)反應(yīng)的因素主要有電解質(zhì)、溫度、pH值等。第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日第2節(jié)細(xì)胞免疫技術(shù)的種類與用途細(xì)胞免疫技術(shù)是指與細(xì)胞免疫有關(guān)的各種檢測(cè)技術(shù)，包括對(duì)其免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子的檢測(cè)及功能分析。由于人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到細(xì)胞免疫在腫瘤、胞內(nèi)菌感染、病毒感染等疾病免疫中的重要性，使近幾年來細(xì)胞免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究與臨床中應(yīng)用越來越廣。

第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日第2節(jié)細(xì)胞免疫技術(shù)的種類與用途

根據(jù)被檢測(cè)的物質(zhì)性質(zhì)不同，可將細(xì)胞免疫技術(shù)分為淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類技術(shù)、淋巴細(xì)胞功能測(cè)定技術(shù)和細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)以及體內(nèi)細(xì)胞免疫試驗(yàn)等4大類。CIK是(cytokineinducedkiller)的縮寫，最初是指在正常人體外周血中只占1～5%的cd3+cd56+的T淋巴細(xì)胞?目前國(guó)內(nèi)外制備的用于過繼免疫治療的cik細(xì)胞，實(shí)際上是體外擴(kuò)增出的以cd3+cd56+?cd3+cd8+為主的異質(zhì)性細(xì)胞群。該細(xì)胞群是在多種細(xì)胞因子如IL-2?IFN-γ及某些單克隆抗體(anti-cd3mcab)的刺激下，由從外周血?骨髓或臍血中分離出來的單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增而成，具有廣泛的非MHC限制的極強(qiáng)的溶瘤活性?第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日第2節(jié)細(xì)胞免疫技術(shù)的種類與用途

根據(jù)被檢測(cè)的物質(zhì)性質(zhì)不同，可將細(xì)胞免疫技術(shù)分為淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類技術(shù)、淋巴細(xì)胞功能測(cè)定技術(shù)和細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)以及體內(nèi)細(xì)胞免疫試驗(yàn)等4大類。生物治療技術(shù)是一種“自身免疫細(xì)胞療法”，它用“人體自身的免疫細(xì)胞殺死自己體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞”的原理來治療腫瘤，是最具優(yōu)勢(shì)、最有前景的腫瘤治療技術(shù)之一。通過提取患者自身外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，在GMP超潔凈實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行誘導(dǎo)，激活和數(shù)量擴(kuò)增成樹突狀細(xì)胞（DC）和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK），然后再回輸給病人。這兩種細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性識(shí)別作用，能夠廣泛識(shí)別各種腫瘤細(xì)胞。當(dāng)DC與CIK細(xì)胞聯(lián)合作用將殘留惡性腫瘤細(xì)胞完全殺滅或降低并穩(wěn)定在一定水平時(shí)，即可達(dá)到腫瘤的臨床治療或控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日

該技術(shù)有效修復(fù)、增強(qiáng)了人體的免疫系統(tǒng)，減少了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的幾率，無痛苦，無副作用，對(duì)于手術(shù)結(jié)束后或放療緩解期患者尤為適合。對(duì)于部分乙肝患者也可采用該方法治療

生物免疫治療大致分為五個(gè)主要步驟，首先是前期檢查，第二是采集外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，第三步就是細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室的激活、誘導(dǎo)與質(zhì)控，第四步是回輸?shù)诙?，共四十八頁?022年，8月28日CIK細(xì)胞的特點(diǎn)1、增殖能力強(qiáng)，主要效用細(xì)胞CD3+CD56+可增殖1000倍；2、殺傷活力強(qiáng)，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的LAK細(xì)胞和細(xì)胞因子γ干擾素、白細(xì)胞介素2等；3、殺瘤譜廣，不受MHC限制，具有廣譜殺腫瘤和病毒的作用，對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞仍敏感，殺瘤活性不受環(huán)孢素A（CsA）和FK506等免疫抑制劑的影響，能抵抗腫瘤細(xì)胞引發(fā)的效應(yīng)細(xì)胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小，無嚴(yán)重不良反應(yīng)。不過長(zhǎng)度超過30bp的dsRNA會(huì)由于干擾素α應(yīng)答引發(fā)非特異性基因抑制。第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日CIK細(xì)胞治療技術(shù)的優(yōu)勢(shì)1、可有清除手術(shù)、放化療后殘余的癌細(xì)胞及微小病灶，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；2、可與放、化療聯(lián)合使用，能降低放化療的毒副作用的感染率，提高放化療的療效；3、可用于放、化療無效的患者，或?qū)熕幬锂a(chǎn)生耐藥性的患者的治療；第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日CIK細(xì)胞治療技術(shù)的優(yōu)勢(shì)4、對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)或已復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤患者，能迅速緩解其臨床癥狀，延長(zhǎng)生存期；大部分患者出現(xiàn)瘤體減小甚至消失或長(zhǎng)期帶瘤生存的治療效果；5、由于CIK細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)和體細(xì)胞修復(fù)作用，在治療腫瘤的同時(shí)，大部分患者尤其是放化療后的患者，可出現(xiàn)消化道癥狀減輕或消失，皮膚有光澤，黑斑淡化，靜脈曲張消失，脫發(fā)停止甚至頭發(fā)生長(zhǎng)或白發(fā)變黑等“年輕化”表現(xiàn)，及精神狀態(tài)或體力明顯恢復(fù)等現(xiàn)象，從而提高腫瘤患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日激光共聚焦顯微鏡第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日

細(xì)胞免疫技術(shù)的特點(diǎn)：（1）方法復(fù)雜，根據(jù)不同檢測(cè)對(duì)象需采用不同的方法，這也是細(xì)胞免疫技術(shù)發(fā)展不快的原因；（2）目前逐漸發(fā)展用血清學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞免疫，如用單克隆抗體檢測(cè)CD抗原進(jìn)行T細(xì)胞亞群分析，血清學(xué)反應(yīng)測(cè)定白細(xì)胞介素和干擾素等，即細(xì)胞免疫技術(shù)與血清學(xué)技術(shù)融為一體。

第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日

細(xì)胞免疫技術(shù)的特點(diǎn)：此外，近年來各種先進(jìn)的檢測(cè)儀器應(yīng)用于細(xì)胞免疫技術(shù)，如流式細(xì)胞儀(flowcytometer)、激光共聚焦顯微鏡等，使免疫細(xì)胞表面分子的檢測(cè)、定位及其功能的研究有了較大的發(fā)展。第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日第3節(jié)免疫制備技術(shù)的種類

免疫制備技術(shù)是指制備與免疫檢測(cè)有關(guān)制劑的各種技術(shù)，包括抗原制備、抗體制備、抗體純化及抗體標(biāo)記等技術(shù)。第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日第4節(jié)免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用一、動(dòng)物疫病診斷用免疫血清學(xué)方法對(duì)動(dòng)物傳染病、寄生蟲病等進(jìn)行診斷，是免疫學(xué)技術(shù)最突出的應(yīng)用。應(yīng)用免疫血清學(xué)技術(shù)可以檢測(cè)病原微生物抗原或抗體，其中酶標(biāo)抗體技術(shù)，已成為動(dòng)物多種傳染病的常規(guī)診斷方法，其簡(jiǎn)便、快速，又具有高度的敏感性、特異性和可重復(fù)性，已有許多商品化的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)診斷試劑盒。第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、動(dòng)植物生理活動(dòng)研究動(dòng)物、植物體中存在一些活性物質(zhì)，如激素、維生素等，它們?cè)隗w內(nèi)含量極微少，但在調(diào)節(jié)機(jī)體的生理活動(dòng)中起重要作用，因此可通過分析測(cè)定這些生物活性物質(zhì)的含量及變化來研究機(jī)體的各種生理功能(如生長(zhǎng)、生殖等)。由于這些物質(zhì)含量極低，用常規(guī)檢測(cè)方法不能準(zhǔn)確測(cè)出。第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、動(dòng)植物生理活動(dòng)研究目前放射免疫測(cè)定和酶免疫技術(shù)已能精確測(cè)出ng(10-9g)及pg(10-12g)級(jí)水平的物質(zhì)，它們已成為測(cè)定動(dòng)物、植物、以及昆蟲體內(nèi)微量激素及其他活性物質(zhì)、植物生理和生物防治的重要技術(shù)手段。第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日三、物種及微生物鑒定各種生物之間的差異都可表現(xiàn)在抗原性的不同，物種種源越遠(yuǎn)，抗原性差異越大，因此可用區(qū)分抗原性的血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行物種鑒定與物種的分類等工作。血清學(xué)反應(yīng)在細(xì)菌、病毒等微生物鑒定和血清型及亞型的分析方面已得到廣泛應(yīng)用。但在動(dòng)物種源、植物和昆蟲分類方面還是一個(gè)新領(lǐng)域。第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日四、動(dòng)植物性狀的免疫標(biāo)記通過分析動(dòng)物、植物一些優(yōu)良性狀(如高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性等)的特異性抗原，然后用血清學(xué)方法進(jìn)行標(biāo)記選擇育種，是一個(gè)很有前途的方向，它比分子遺傳標(biāo)記選擇育種簡(jiǎn)便。第四十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日五、生物制品研究生物制品(如疫苗、診斷制品、免疫增強(qiáng)劑等)的研究與開發(fā)，免疫學(xué)技術(shù)是必不可少的支撐技術(shù)。疫苗研究中需用血清學(xué)技術(shù)和細(xì)胞免疫技術(shù)作為免疫效力的評(píng)價(jià)手段。在研究一些免疫增強(qiáng)藥物，尤其研究抗腫瘤藥物時(shí)，需用細(xì)胞免疫技術(shù)分析測(cè)定它們對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的增強(qiáng)作用。第四十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日六、動(dòng)物疫病致病機(jī)理研究動(dòng)物傳染病的病原從機(jī)體特定部位感染，并在特定組織細(xì)胞內(nèi)增殖，引起致病。采用免疫熒光抗體染色