免疫學檢測技術(shù)及應(yīng)用

免疫學檢測技術(shù)及應(yīng)用第一頁，共八十五頁，2022年，8月28日免疫學檢測技術(shù)應(yīng)用：

1.疾病的診斷、治療效果評價及發(fā)病機理探討：如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反應(yīng)、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反應(yīng)、腫瘤等

2.免疫分子的定性、定量測定：如：細胞因子、粘附分子、細胞受體、補體、抗體等第二頁，共八十五頁，2022年，8月28日

3.抗原物質(zhì)的定性、定量檢測：如：病原微生物及其代謝產(chǎn)物，組織細胞、蛋白質(zhì)等

4.免疫細胞的分離、鑒定及功能測定：如：T細胞及其亞群等第三頁，共八十五頁，2022年，8月28日抗原－抗體反應(yīng)抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外相遇可發(fā)生特異性結(jié)合，呈現(xiàn)的某種反應(yīng)現(xiàn)象。

第四頁，共八十五頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)有以下幾個特點:1.抗原與抗體結(jié)合是特異性結(jié)合表位(抗原)——超變區(qū)(抗體)2.抗原抗體結(jié)合是分子表面的非共價鍵結(jié)合

氫鍵、疏水鍵、靜電引力和范德華力(Vanderwaal‘sforce)、電子云力的合力?？乖涂贵w可解離,性質(zhì)不變。

第五頁，共八十五頁，2022年，8月28日3.抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段（1）特異性結(jié)合階段此階段需時短,僅需幾秒到幾分鐘,無可見反應(yīng)出現(xiàn)（2）可見反應(yīng)階段需時較長,數(shù)分,數(shù)小時或數(shù)日出現(xiàn)可見現(xiàn)象,表現(xiàn)為沉淀,凝集,細胞溶解等

4.抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)明顯可見的反應(yīng)現(xiàn)象,與兩者的分子比例密切相關(guān)

第六頁，共八十五頁，2022年，8月28日第七頁，共八十五頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)的主要影響因素：

1.電解質(zhì):

在中性或堿性條件下,抗原抗體均帶負電荷,適當濃度的電解質(zhì)會使它們失去一部分負電荷而互相結(jié)合,出現(xiàn)明顯的沉淀或凝集現(xiàn)象。

2.溫度:37℃3.酸堿度:pH6-8第八頁，共八十五頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)包括：沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)溶解反應(yīng)補體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)已知抗體檢測未知抗原；已知抗原檢測未知抗體。第九頁，共八十五頁，2022年，8月28日Sensitivityofvariorimmunoassays第十頁，共八十五頁，2022年，8月28日一、沉淀反應(yīng)(precipitation)

可溶性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在條件下結(jié)合，出現(xiàn)沉淀物的現(xiàn)象。

沉淀反應(yīng)的試驗方法：環(huán)狀法絮狀法瓊脂中沉淀法

第十一頁，共八十五頁，2022年，8月28日瓊脂中沉淀反應(yīng)法：

雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)

單向免疫擴散(singleradialimmunodiffusion)

對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)

火箭電泳(rocketelectrophoresis)

免疫電泳(immunoelectrophoresis)

第十二頁，共八十五頁，2022年，8月28日第十三頁，共八十五頁，2022年，8月28日二、凝集反應(yīng)(agglutination)

顆粒性抗原或吸附于顆粒上的可溶性抗原(或抗體)于相應(yīng)抗體(或抗原)，在電解質(zhì)存在下出現(xiàn)凝集物的現(xiàn)象。第十四頁，共八十五頁，2022年，8月28日凝集反應(yīng)包括：

◆直接凝集反應(yīng)(directagglutination)

◆間接(被動)凝集反應(yīng)(indirect/passiveagglutination)◆間接凝集抑制試驗(indirectagglutinationinhibitiontest)◆協(xié)同凝集試驗(coagglutinationtest)

◆抗球蛋白試驗(antiglobulintest，Coomb’stest)第十五頁，共八十五頁，2022年，8月28日第十六頁，共八十五頁，2022年，8月28日三.免疫標記技術(shù)用熒光素、同位素、酶及發(fā)光等示蹤物質(zhì)標記抗體(或抗原)，與抗原(或抗體)進行反應(yīng)，通過檢測示蹤物質(zhì)，分析被檢抗原(或抗體)的存在或含量的方法。靈敏度：高，1X10-4

～1X10-5ug抗體/ml

應(yīng)用：微量物質(zhì)的定性、定量或定位。第十七頁，共八十五頁，2022年，8月28日免疫標記技術(shù)的基本類型：（一）免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)（二）免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechnique)

（三）同位素標記技術(shù)(isotopelabellingtechnique)（四）發(fā)光免疫測定(luminescentimmuno-assay,LIA)（五）免疫膠體金標記技術(shù)(colloidalgold

／immunogoldstaining)第十八頁，共八十五頁，2022年，8月28日（一）免疫熒光技術(shù)(又稱熒光抗體技術(shù))

原理：用熒光素(如異硫氰酸熒光素、羅丹明B200等)標記抗體(熒光抗體)，用熒光抗體浸染細胞或組織切片，抗原與熒光抗體結(jié)合，于熒光顯微鏡下觀察熒光，確定被檢抗原的存在。免疫熒光技術(shù)包括：直接法間接法間接補體增強法

第十九頁，共八十五頁，2022年，8月28日Directandindirectimmunofluore-scencestainingofmembraneantigen(mAg).第二十頁，共八十五頁，2022年，8月28日（二）免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)

是將抗原抗體反應(yīng)與酶催化底物的作用相結(jié)合的一種方法。主要有兩種類型：

1.免疫酶染色

2.酶免疫測定（enzymeimmunoassay,EIA）第二十一頁，共八十五頁，2022年，8月28日1.免疫酶染色(又稱免疫組化技術(shù),immunohistochemistrytechnique)

原理：用酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)標記抗體(酶標抗體)，將酶標抗體與抗原(細胞或組織切片)作用，抗原與酶標記抗體結(jié)合，加底物，酶催化底物產(chǎn)生有色物質(zhì)，觀察結(jié)果。應(yīng)用：細胞內(nèi)、組織內(nèi)抗原的定性、定量和定位檢測。第二十二頁，共八十五頁，2022年，8月28日2.酶免疫測定

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)

原理：①將抗原(或抗體)結(jié)合于固相載體；②與抗體(或抗原)反應(yīng)；③加酶底物，酶促反應(yīng)。靈敏度：2X10-5μg／ml

應(yīng)用：廣泛，可檢測微量抗體和抗原(如微生物成分、激素、細胞因子、粘附分子等）。第二十三頁，共八十五頁，2022年，8月28日

ELISA法：直接法間接法雙抗體夾心法(雙位點法)

競爭法第二十四頁，共八十五頁，2022年，8月28日ELISA第二十五頁，共八十五頁，2022年，8月28日(三)同位素標記技術(shù)(isotope-labellingtechnique)

放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)

是一種用放射性同位素分析抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合方法。

優(yōu)點：靈敏度高,可檢測0.001pg／mL

特異性強應(yīng)用：微量抗原和抗體檢測。缺點：不穩(wěn)定，廢物處理麻煩等。第二十六頁，共八十五頁，2022年，8月28日（四）發(fā)光免疫分析(luminescentimmuno-assay,LIA)

原理：用發(fā)光物質(zhì)標記抗體(或抗原),再同抗原(或抗體)進行反應(yīng)，以發(fā)光現(xiàn)象作為抗原抗體反應(yīng)的指示系統(tǒng)。應(yīng)用：定量檢測抗原、抗體。發(fā)光分為：化學發(fā)光(chemiluminescence)

生物發(fā)光（bioluminescence）第二十七頁，共八十五頁，2022年，8月28日化學發(fā)光原理：發(fā)光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子基態(tài)分子釋放光子(發(fā)光)

化學發(fā)光劑：魯米諾（luminol）反應(yīng)劑：過氧化陰離子反應(yīng)劑第二十八頁，共八十五頁，2022年，8月28日（五）免疫膠體金技術(shù)(colloidalgold／immunogoldstaining)

原理：膠體金標記蛋白質(zhì)(如抗體)+組織細胞(待測)觀察結(jié)果(用電鏡、光鏡或肉眼)

應(yīng)用：免疫組織化學定位，測定細胞表面標志和細胞內(nèi)成分。優(yōu)點：易行、省時、價廉、靈敏度高。

膠體金：用還原法將四氯金酸(HAuCl4)制成特定大小的金顆粒，該顆粒由于靜電作用呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。第二十九頁，共八十五頁，2022年，8月28日淋巴細胞的檢測技術(shù)一.淋巴細胞的分離

1.外周血單個核細胞(淋巴細胞>90%)的分離密度梯度離心法

(密度為1.077)(2000rpm,15min)第三十頁，共八十五頁，2022年，8月28日2.尼龍纖維分離法：

單個核細胞通過尼龍纖維柱

B細胞和單核細胞(粘附特性)T細胞(非粘附性)。3.流式細胞術(shù)（flowcytometry,FCM）：

熒光素標記抗體＋待檢細胞單列經(jīng)過FACS分離（熒光素不同）的細胞*FACS：熒光激活細胞分類儀(fluore-scentactivatedcellsorter)第三十一頁，共八十五頁，2022年，8月28日流式細胞儀第三十二頁，共八十五頁，2022年，8月28日第三十三頁，共八十五頁，2022年，8月28日4.磁珠分離術(shù)：

(1)直接法：免疫磁珠(磁性微粒結(jié)合抗體)+細胞通過磁場分離磁珠結(jié)合細胞+解離劑獲純化細胞

(2)間接法：免疫磁珠(磁性微粒結(jié)合第二抗體)+細胞+抗體通過磁場分離磁珠結(jié)合細胞+解離劑獲純化細胞

第三十四頁，共八十五頁，2022年，8月28日第三十五頁，共八十五頁，2022年，8月28日

淋巴細胞的功能測定技術(shù)（一）體外法

1．淋巴細胞增殖檢測3H-胸腺嘧啶核苷參入法（3H-TdR）:

間接觀察DNA合成含量。靈敏度高，具有放射性。四甲基偶氮唑鹽法（MTT）:MTT商品名為噻唑藍。原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將外源性MTT還原成藍紫色結(jié)晶-甲瓚（formazan）,DMSO使其溶解，酶標分析儀檢測。簡便，靈敏度高，穩(wěn)定性差。第三十六頁，共八十五頁，2022年，8月28日二甲氧唑黃比色法（XTT）：XTT是一種MTT類似的四唑氮衍生物，活細胞將其還原成橘黃色甲瓚產(chǎn)物，水溶性，可直接酶標儀測定。加上電子耦合劑硫酸酚嗪甲酯（PMS）可提高其效率。快速、簡便靈敏。XTT水溶液不穩(wěn)定，現(xiàn)用現(xiàn)配，穩(wěn)定性差。第三十七頁，共八十五頁，2022年，8月28日四唑單鈉鹽法（WST-1）:WAT-1是一種類似于MTT的水溶性四唑鹽，在PMS存在下被活細胞脫氫酶還原成橙黃色甲瓚產(chǎn)物，水溶性，直接酶標儀測定。WAT-1的水溶液比MTT和XTT穩(wěn)定。結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高。可多次用酶標儀重復(fù)檢測結(jié)果。Cell-CountingKit-8（CCK-8）:CCK-8中含有WST-8，較WST-1更新的四唑鹽，檢測原理與WST-1類似。操作更簡便，檢測結(jié)果更穩(wěn)定、溶解性更高、靈敏度更高、保存時間更長。第三十八頁，共八十五頁，2022年，8月28日（放射性核素攝取法）第三十九頁，共八十五頁，2022年，8月28日2.細胞毒試驗(1)NK細胞的細胞毒活性測定①放射性核素釋放法放射性核素標記靶細胞(K562細胞)+效應(yīng)細胞培養(yǎng)靶細胞破壞，釋放放射性核素測cpm值

NK細胞毒活性(%)=100%實驗孔cpm值-自然釋放孔cpm值最大釋放孔cpm值-自然釋放孔cpm值第四十頁，共八十五頁，2022年，8月28日②乳酸脫氫酶(LDH)釋放法靶細胞(YAC-1細胞)+效應(yīng)細胞(小鼠脾胞)LDH釋放+LDH底物(氧化型輔酶I、吩嗪二甲酯硫酸鹽和硝基氯化四氮唑藍)形成甲基化合物(色)測定OD570值

NK細胞毒活性(%)=100%實驗孔OD值-自然釋放孔OD值最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值第四十一頁，共八十五頁，2022年，8月28日

Antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity(ADCC）第四十二頁，共八十五頁，2022年，8月28日第四十三頁，共八十五頁，2022年，8月28日GenerationofeffectorCTLs第四十四頁，共八十五頁，2022年，8月28日MHCtetramers第四十五頁，共八十五頁，2022年，8月28日Twopathwaysoftarget-cellapoptosisstimulatedbyCTLs第四十六頁，共八十五頁，2022年，8月28日Invitrocell-mediatedlympholysis(CML)assay第四十七頁，共八十五頁，2022年，8月28日3.酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)

抗原包被B細胞抗體產(chǎn)生并附著第二抗體(酶標記)底物顯色抗體(抗細胞因子)包被+T細胞產(chǎn)生細胞因子并與抗體結(jié)合+第二抗體(酶標記)底物顯色第四十八頁，共八十五頁，2022年，8月28日第四十九頁，共八十五頁，2022年，8月28日第五十頁，共八十五頁，2022年，8月28日第五十一頁，共八十五頁，2022年，8月28日（二）體內(nèi)法抗原定量注入皮內(nèi)，48～72小時后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：陽性：注射局部出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)，直徑>0.5cm

弱陽性：硬結(jié)直徑<0.5cm

陰性：無變化實際意義：陽性——

細胞免疫功能正常者弱陽性或陰性——

多為細胞免疫功能低下者*常用的抗原為結(jié)核菌素(OT)、PHA第五十二頁，共八十五頁，2022年，8月28日皮內(nèi)注射法第五十三頁，共八十五頁，2022年，8月28日劃痕法第五十四頁，共八十五頁，2022年，8月28日第五十五頁，共八十五頁，2022年，8月28日細胞因子的檢測技術(shù)一、生物學檢測技術(shù)依賴細胞株測定法二、免疫學檢測技術(shù)ELISA法三、分子生物學檢測技術(shù)分子雜交、PCR

等檢測mRNA

第五十六頁，共八十五頁，2022年，8月28日細胞因子檢測的特點樣品含量低樣品具有時效性生物效應(yīng)特異性差第五十七頁，共八十五頁，2022年，8月28日Figure14-12第五十八頁，共八十五頁，2022年，8月28日第五十九頁，共八十五頁，2022年，8月28日細胞因子的功能

CellactivationCellgrowthanddifferentiationInductionofMHCInductionofcytokinereceptorsPromotionofantibodyclass-switching第六十頁，共八十五頁，2022年，8月28日影響細胞因子作用特異性的因素

Onlyantigen-activatedlymphocytesexpressreceptorsDifferentcombinationsofreceptorsubunitsresultinlow-,intermediate-,orhigh-affinityreceptorsRequirementofcell-cellinteractionShorthalf-lifeofcytokinesCytokineantagonistsSynergisticandantagonisticinteractionsamongcytokines第六十一頁，共八十五頁，2022年，8月28日限制細胞因子臨床應(yīng)用的因素HighlocalconcentrationsofcytokinesduringimmuneresponsecannotbemimickedclinicallyShorthalf-lifeofcytokinesPleiotropiceffectscancauseunpredictableside-effects第六十二頁，共八十五頁，2022年，8月28日細胞因子的生物學檢測檢測方法與原理細胞增殖或增殖抑制試驗細胞病變抑制試驗細胞毒試驗細胞趨化試驗第六十三頁，共八十五頁，2022年，8月28日

檢測中的操作注意要點靶細胞的選擇與培養(yǎng)檢測標本的制備顯示檢測結(jié)果2023/1/19第六十四頁，共八十五頁，2022年，8月28日靶細胞的選擇與培養(yǎng)

1、對所測的細胞因子有特異的敏感性

2、易培養(yǎng)、保存、生物學特性穩(wěn)定

3、有良好的生長狀態(tài)

4、種屬適配2023/1/19第六十五頁，共八十五頁，2022年，8月28日

各類細胞因子檢測的常用靶細胞

細胞因子實驗系統(tǒng)干擾因素

IL-1D10（M）增殖法IL-2、IL-4EL-4（M）增殖法IL-4A352（H）增殖抑制法

IL-2CTLL（M）增殖法IL-4IL-3KG-1（H）增殖法

TF-1（H）增殖法GN-CSF、IL-5IL-6、EPOIL-4CTLL（M）增殖法IL-2IL-5BCL-1（M）增殖法IL-4第六十六頁，共八十五頁，2022年，8月28日各類細胞因子檢測的常用靶細胞

細胞因子實驗系統(tǒng)干擾因素

IL-6B9（M）增殖法IL-4、IL-11BM60（H）增殖法

IL-7Clone-IXN/2b（M）增殖法

IL-8中性粒細胞（M、H）趨化法

GM-CSFTF-1（H）增殖法IL-3、IL-5IL-6、IL-5TNF/L929（M、H）細胞毒法

IFNwish（H）病變保護法IFN-IFN-L929（M）病變保護法IFN-IFN-

第六十七頁，共八十五頁，2022年，8月28日檢測標本的準備

1、分離特定的產(chǎn)生細胞

2、對產(chǎn)生細胞進行誘導(dǎo)、激活

3、選擇適當?shù)氖占瘯r間2023/1/19第六十八頁，共八十五頁，2022年，8月28日顯示檢測結(jié)果

1、細胞增殖狀態(tài)的顯示：放射性核素摻入法、胞內(nèi)酶活性顯示法活細胞染色法細胞熒光測定法

2、細胞毒或細胞病變狀態(tài)的顯示活細胞染色法胞內(nèi)酶活性顯示法

DNA斷片測定法2023/1/19第六十九頁，共八十五頁，2022年，8月28日

依賴細胞株測定法PBMC+PHA培養(yǎng)取上清液

+CTLL-2細胞培養(yǎng)+MTT培養(yǎng)測OD570值

第七十頁，共八十五頁，2022年，8月28日TNF對靶細胞的細胞毒活性

TNF對小鼠L929成纖維細胞株具有細胞毒活性，細胞死亡率與TNF生物學活性成正相關(guān)關(guān)系。結(jié)晶紫染色死細胞

MTT檢測活細胞如同時加用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D，可提高靶細胞對TNF的敏感性10-100倍。第七十一頁，共八十五頁，2022年，8月28日

濾膜：計數(shù)受趨化細胞趨化因子細胞趨化試驗原理示意第七十二頁，共八十五頁，2022年，8月28日

細胞因子的免疫學檢測

分泌型細胞因子的檢測

ELISAELISPOTRT-PCR（分子生物學）細胞內(nèi)細胞因子的檢測

免疫組化技術(shù)第七十三頁，共八十五頁，2022年，8月28日細胞因子受體的存在形式

膜型細胞因子受體分泌型細胞因子受體2023/1/19第七十四頁，共八十五頁，2022年，8月28日細胞因子受體的檢測方法膜型細胞因子受體的檢測：配體檢測法抗體檢測法分泌型細胞因子受體的檢測：標記抗體檢測法2023/1/19第七十五頁，共八十五頁，2022年，8月28日

細胞因子檢測臨床意義細胞因子正常對照病人疾病年代及受體（pg/ml）（pg/ml）

IL-10.16±0.170.53±0.57腎細胞癌20030.318.8心絞痛199616±6.738.5±28.8胰腺炎1994IL-22.4±0.810.8±1.8急性缺血性綜合征1999IL-43.34±0.844.05±1.02支氣管高反應(yīng)性2003IL-654.1485.2瘧疾20041.79±2.038.91±13.12腎細胞癌2002

421620敗血癥20012.1±0.110±1.6風濕20002.554.29非酒精性脂肪肝20031.1±0.118.6±2.1原發(fā)性甲狀旁腺功1996

能亢進癥

4.34±0.997.3±0.97宮外孕1996

12.3±0.894±12.1類風濕關(guān)節(jié)炎19990.3916關(guān)節(jié)炎20041.2±0.610.8±1.8急性缺血性綜合征1999IL-6受體25.1±1(ng/ml)41.7±1.2(ng/ml)原發(fā)性甲狀旁腺功能1996（可溶性）亢進癥第七十六頁，共八十五頁，2022年，8月28日

續(xù)表細胞因子正常對照病人疾病年代及受體（pg/ml）（pg/ml）IL-863331敗血癥20013.843.68非酒精性脂肪肝2003

16.31078±181.5泌尿道感染

1993117.6肝癌20034.8±0.527.5±2.6輕度子宮內(nèi)膜異位癥2003530.2±65.1重度子宮內(nèi)膜異位癥IL-1014.11099.3嚴重瘧疾20049.2±1.517.7±4.4非小細胞肺癌200221±4.2轉(zhuǎn)移癌IL-1335.20±12.7092.69±9.87系統(tǒng)性紅斑狼瘡2005IL-1516.2±435±6腹膜炎