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文檔簡介
免疫學(xué)檢測技術(shù)及應(yīng)用第一頁,共八十五頁,2022年,8月28日免疫學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用:
1.疾病的診斷、治療效果評價(jià)及發(fā)病機(jī)理探討:如:感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反應(yīng)、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反應(yīng)、腫瘤等
2.免疫分子的定性、定量測定:如:細(xì)胞因子、粘附分子、細(xì)胞受體、補(bǔ)體、抗體等第二頁,共八十五頁,2022年,8月28日
3.抗原物質(zhì)的定性、定量檢測:如:病原微生物及其代謝產(chǎn)物,組織細(xì)胞、蛋白質(zhì)等
4.免疫細(xì)胞的分離、鑒定及功能測定:如:T細(xì)胞及其亞群等第三頁,共八十五頁,2022年,8月28日抗原-抗體反應(yīng)抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外相遇可發(fā)生特異性結(jié)合,呈現(xiàn)的某種反應(yīng)現(xiàn)象。
第四頁,共八十五頁,2022年,8月28日抗原抗體反應(yīng)有以下幾個(gè)特點(diǎn):1.抗原與抗體結(jié)合是特異性結(jié)合表位(抗原)——超變區(qū)(抗體)2.抗原抗體結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合
氫鍵、疏水鍵、靜電引力和范德華力(Vanderwaal‘sforce)、電子云力的合力。抗原和抗體可解離,性質(zhì)不變。
第五頁,共八十五頁,2022年,8月28日3.抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段(1)特異性結(jié)合階段此階段需時(shí)短,僅需幾秒到幾分鐘,無可見反應(yīng)出現(xiàn)(2)可見反應(yīng)階段需時(shí)較長,數(shù)分,數(shù)小時(shí)或數(shù)日出現(xiàn)可見現(xiàn)象,表現(xiàn)為沉淀,凝集,細(xì)胞溶解等
4.抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)明顯可見的反應(yīng)現(xiàn)象,與兩者的分子比例密切相關(guān)
第六頁,共八十五頁,2022年,8月28日第七頁,共八十五頁,2022年,8月28日抗原抗體反應(yīng)的主要影響因素:
1.電解質(zhì):
在中性或堿性條件下,抗原抗體均帶負(fù)電荷,適當(dāng)濃度的電解質(zhì)會使它們失去一部分負(fù)電荷而互相結(jié)合,出現(xiàn)明顯的沉淀或凝集現(xiàn)象。
2.溫度:37℃3.酸堿度:pH6-8第八頁,共八十五頁,2022年,8月28日抗原抗體反應(yīng)包括:沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)溶解反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)已知抗體檢測未知抗原;已知抗原檢測未知抗體。第九頁,共八十五頁,2022年,8月28日Sensitivityofvariorimmunoassays第十頁,共八十五頁,2022年,8月28日一、沉淀反應(yīng)(precipitation)
可溶性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在條件下結(jié)合,出現(xiàn)沉淀物的現(xiàn)象。
沉淀反應(yīng)的試驗(yàn)方法:環(huán)狀法絮狀法瓊脂中沉淀法
第十一頁,共八十五頁,2022年,8月28日瓊脂中沉淀反應(yīng)法:
雙向免疫擴(kuò)散(doubleimmunodiffusion)
單向免疫擴(kuò)散(singleradialimmunodiffusion)
對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)
火箭電泳(rocketelectrophoresis)
免疫電泳(immunoelectrophoresis)
第十二頁,共八十五頁,2022年,8月28日第十三頁,共八十五頁,2022年,8月28日二、凝集反應(yīng)(agglutination)
顆粒性抗原或吸附于顆粒上的可溶性抗原(或抗體)于相應(yīng)抗體(或抗原),在電解質(zhì)存在下出現(xiàn)凝集物的現(xiàn)象。第十四頁,共八十五頁,2022年,8月28日凝集反應(yīng)包括:
◆直接凝集反應(yīng)(directagglutination)
◆間接(被動(dòng))凝集反應(yīng)(indirect/passiveagglutination)◆間接凝集抑制試驗(yàn)(indirectagglutinationinhibitiontest)◆協(xié)同凝集試驗(yàn)(coagglutinationtest)
◆抗球蛋白試驗(yàn)(antiglobulintest,Coomb’stest)第十五頁,共八十五頁,2022年,8月28日第十六頁,共八十五頁,2022年,8月28日三.免疫標(biāo)記技術(shù)用熒光素、同位素、酶及發(fā)光等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體(或抗原),與抗原(或抗體)進(jìn)行反應(yīng),通過檢測示蹤物質(zhì),分析被檢抗原(或抗體)的存在或含量的方法。靈敏度:高,1X10-4
~1X10-5ug抗體/ml
應(yīng)用:微量物質(zhì)的定性、定量或定位。第十七頁,共八十五頁,2022年,8月28日免疫標(biāo)記技術(shù)的基本類型:(一)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)(二)免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechnique)
(三)同位素標(biāo)記技術(shù)(isotopelabellingtechnique)(四)發(fā)光免疫測定(luminescentimmuno-assay,LIA)(五)免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)(colloidalgold
/immunogoldstaining)第十八頁,共八十五頁,2022年,8月28日(一)免疫熒光技術(shù)(又稱熒光抗體技術(shù))
原理:用熒光素(如異硫氰酸熒光素、羅丹明B200等)標(biāo)記抗體(熒光抗體),用熒光抗體浸染細(xì)胞或組織切片,抗原與熒光抗體結(jié)合,于熒光顯微鏡下觀察熒光,確定被檢抗原的存在。免疫熒光技術(shù)包括:直接法間接法間接補(bǔ)體增強(qiáng)法
第十九頁,共八十五頁,2022年,8月28日Directandindirectimmunofluore-scencestainingofmembraneantigen(mAg).第二十頁,共八十五頁,2022年,8月28日(二)免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)
是將抗原抗體反應(yīng)與酶催化底物的作用相結(jié)合的一種方法。主要有兩種類型:
1.免疫酶染色
2.酶免疫測定(enzymeimmunoassay,EIA)第二十一頁,共八十五頁,2022年,8月28日1.免疫酶染色(又稱免疫組化技術(shù),immunohistochemistrytechnique)
原理:用酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)標(biāo)記抗體(酶標(biāo)抗體),將酶標(biāo)抗體與抗原(細(xì)胞或組織切片)作用,抗原與酶標(biāo)記抗體結(jié)合,加底物,酶催化底物產(chǎn)生有色物質(zhì),觀察結(jié)果。應(yīng)用:細(xì)胞內(nèi)、組織內(nèi)抗原的定性、定量和定位檢測。第二十二頁,共八十五頁,2022年,8月28日2.酶免疫測定
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)
原理:①將抗原(或抗體)結(jié)合于固相載體;②與抗體(或抗原)反應(yīng);③加酶底物,酶促反應(yīng)。靈敏度:2X10-5μg/ml
應(yīng)用:廣泛,可檢測微量抗體和抗原(如微生物成分、激素、細(xì)胞因子、粘附分子等)。第二十三頁,共八十五頁,2022年,8月28日
ELISA法:直接法間接法雙抗體夾心法(雙位點(diǎn)法)
競爭法第二十四頁,共八十五頁,2022年,8月28日ELISA第二十五頁,共八十五頁,2022年,8月28日(三)同位素標(biāo)記技術(shù)(isotope-labellingtechnique)
放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)
是一種用放射性同位素分析抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合方法。
優(yōu)點(diǎn):靈敏度高,可檢測0.001pg/mL
特異性強(qiáng)應(yīng)用:微量抗原和抗體檢測。缺點(diǎn):不穩(wěn)定,廢物處理麻煩等。第二十六頁,共八十五頁,2022年,8月28日(四)發(fā)光免疫分析(luminescentimmuno-assay,LIA)
原理:用發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗體(或抗原),再同抗原(或抗體)進(jìn)行反應(yīng),以發(fā)光現(xiàn)象作為抗原抗體反應(yīng)的指示系統(tǒng)。應(yīng)用:定量檢測抗原、抗體。發(fā)光分為:化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)
生物發(fā)光(bioluminescence)第二十七頁,共八十五頁,2022年,8月28日化學(xué)發(fā)光原理:發(fā)光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子基態(tài)分子釋放光子(發(fā)光)
化學(xué)發(fā)光劑:魯米諾(luminol)反應(yīng)劑:過氧化陰離子反應(yīng)劑第二十八頁,共八十五頁,2022年,8月28日(五)免疫膠體金技術(shù)(colloidalgold/immunogoldstaining)
原理:膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)(如抗體)+組織細(xì)胞(待測)觀察結(jié)果(用電鏡、光鏡或肉眼)
應(yīng)用:免疫組織化學(xué)定位,測定細(xì)胞表面標(biāo)志和細(xì)胞內(nèi)成分。優(yōu)點(diǎn):易行、省時(shí)、價(jià)廉、靈敏度高。
膠體金:用還原法將四氯金酸(HAuCl4)制成特定大小的金顆粒,該顆粒由于靜電作用呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài),稱為膠體金。第二十九頁,共八十五頁,2022年,8月28日淋巴細(xì)胞的檢測技術(shù)一.淋巴細(xì)胞的分離
1.外周血單個(gè)核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞>90%)的分離密度梯度離心法
(密度為1.077)(2000rpm,15min)第三十頁,共八十五頁,2022年,8月28日2.尼龍纖維分離法:
單個(gè)核細(xì)胞通過尼龍纖維柱
B細(xì)胞和單核細(xì)胞(粘附特性)T細(xì)胞(非粘附性)。3.流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM):
熒光素標(biāo)記抗體+待檢細(xì)胞單列經(jīng)過FACS分離(熒光素不同)的細(xì)胞*FACS:熒光激活細(xì)胞分類儀(fluore-scentactivatedcellsorter)第三十一頁,共八十五頁,2022年,8月28日流式細(xì)胞儀第三十二頁,共八十五頁,2022年,8月28日第三十三頁,共八十五頁,2022年,8月28日4.磁珠分離術(shù):
(1)直接法:免疫磁珠(磁性微粒結(jié)合抗體)+細(xì)胞通過磁場分離磁珠結(jié)合細(xì)胞+解離劑獲純化細(xì)胞
(2)間接法:免疫磁珠(磁性微粒結(jié)合第二抗體)+細(xì)胞+抗體通過磁場分離磁珠結(jié)合細(xì)胞+解離劑獲純化細(xì)胞
第三十四頁,共八十五頁,2022年,8月28日第三十五頁,共八十五頁,2022年,8月28日
淋巴細(xì)胞的功能測定技術(shù)(一)體外法
1.淋巴細(xì)胞增殖檢測3H-胸腺嘧啶核苷參入法(3H-TdR):
間接觀察DNA合成含量。靈敏度高,具有放射性。四甲基偶氮唑鹽法(MTT):MTT商品名為噻唑藍(lán)。原理:活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將外源性MTT還原成藍(lán)紫色結(jié)晶-甲瓚(formazan),DMSO使其溶解,酶標(biāo)分析儀檢測。簡便,靈敏度高,穩(wěn)定性差。第三十六頁,共八十五頁,2022年,8月28日二甲氧唑黃比色法(XTT):XTT是一種MTT類似的四唑氮衍生物,活細(xì)胞將其還原成橘黃色甲瓚產(chǎn)物,水溶性,可直接酶標(biāo)儀測定。加上電子耦合劑硫酸酚嗪甲酯(PMS)可提高其效率??焖佟⒑啽沆`敏。XTT水溶液不穩(wěn)定,現(xiàn)用現(xiàn)配,穩(wěn)定性差。第三十七頁,共八十五頁,2022年,8月28日四唑單鈉鹽法(WST-1):WAT-1是一種類似于MTT的水溶性四唑鹽,在PMS存在下被活細(xì)胞脫氫酶還原成橙黃色甲瓚產(chǎn)物,水溶性,直接酶標(biāo)儀測定。WAT-1的水溶液比MTT和XTT穩(wěn)定。結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度高??啥啻斡妹笜?biāo)儀重復(fù)檢測結(jié)果。Cell-CountingKit-8(CCK-8):CCK-8中含有WST-8,較WST-1更新的四唑鹽,檢測原理與WST-1類似。操作更簡便,檢測結(jié)果更穩(wěn)定、溶解性更高、靈敏度更高、保存時(shí)間更長。第三十八頁,共八十五頁,2022年,8月28日(放射性核素?cái)z取法)第三十九頁,共八十五頁,2022年,8月28日2.細(xì)胞毒試驗(yàn)(1)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測定①放射性核素釋放法放射性核素標(biāo)記靶細(xì)胞(K562細(xì)胞)+效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)靶細(xì)胞破壞,釋放放射性核素測cpm值
NK細(xì)胞毒活性(%)=100%實(shí)驗(yàn)孔cpm值-自然釋放孔cpm值最大釋放孔cpm值-自然釋放孔cpm值第四十頁,共八十五頁,2022年,8月28日②乳酸脫氫酶(LDH)釋放法靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)+效應(yīng)細(xì)胞(小鼠脾胞)LDH釋放+LDH底物(氧化型輔酶I、吩嗪二甲酯硫酸鹽和硝基氯化四氮唑藍(lán))形成甲基化合物(色)測定OD570值
NK細(xì)胞毒活性(%)=100%實(shí)驗(yàn)孔OD值-自然釋放孔OD值最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值第四十一頁,共八十五頁,2022年,8月28日
Antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity(ADCC)第四十二頁,共八十五頁,2022年,8月28日第四十三頁,共八十五頁,2022年,8月28日GenerationofeffectorCTLs第四十四頁,共八十五頁,2022年,8月28日MHCtetramers第四十五頁,共八十五頁,2022年,8月28日Twopathwaysoftarget-cellapoptosisstimulatedbyCTLs第四十六頁,共八十五頁,2022年,8月28日Invitrocell-mediatedlympholysis(CML)assay第四十七頁,共八十五頁,2022年,8月28日3.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)
抗原包被B細(xì)胞抗體產(chǎn)生并附著第二抗體(酶標(biāo)記)底物顯色抗體(抗細(xì)胞因子)包被+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子并與抗體結(jié)合+第二抗體(酶標(biāo)記)底物顯色第四十八頁,共八十五頁,2022年,8月28日第四十九頁,共八十五頁,2022年,8月28日第五十頁,共八十五頁,2022年,8月28日第五十一頁,共八十五頁,2022年,8月28日(二)體內(nèi)法抗原定量注入皮內(nèi),48~72小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果判定:陽性:注射局部出現(xiàn)紅腫、硬結(jié),直徑>0.5cm
弱陽性:硬結(jié)直徑<0.5cm
陰性:無變化實(shí)際意義:陽性——
細(xì)胞免疫功能正常者弱陽性或陰性——
多為細(xì)胞免疫功能低下者*常用的抗原為結(jié)核菌素(OT)、PHA第五十二頁,共八十五頁,2022年,8月28日皮內(nèi)注射法第五十三頁,共八十五頁,2022年,8月28日劃痕法第五十四頁,共八十五頁,2022年,8月28日第五十五頁,共八十五頁,2022年,8月28日細(xì)胞因子的檢測技術(shù)一、生物學(xué)檢測技術(shù)依賴細(xì)胞株測定法二、免疫學(xué)檢測技術(shù)ELISA法三、分子生物學(xué)檢測技術(shù)分子雜交、PCR
等檢測mRNA
第五十六頁,共八十五頁,2022年,8月28日細(xì)胞因子檢測的特點(diǎn)樣品含量低樣品具有時(shí)效性生物效應(yīng)特異性差第五十七頁,共八十五頁,2022年,8月28日Figure14-12第五十八頁,共八十五頁,2022年,8月28日第五十九頁,共八十五頁,2022年,8月28日細(xì)胞因子的功能
CellactivationCellgrowthanddifferentiationInductionofMHCInductionofcytokinereceptorsPromotionofantibodyclass-switching第六十頁,共八十五頁,2022年,8月28日影響細(xì)胞因子作用特異性的因素
Onlyantigen-activatedlymphocytesexpressreceptorsDifferentcombinationsofreceptorsubunitsresultinlow-,intermediate-,orhigh-affinityreceptorsRequirementofcell-cellinteractionShorthalf-lifeofcytokinesCytokineantagonistsSynergisticandantagonisticinteractionsamongcytokines第六十一頁,共八十五頁,2022年,8月28日限制細(xì)胞因子臨床應(yīng)用的因素HighlocalconcentrationsofcytokinesduringimmuneresponsecannotbemimickedclinicallyShorthalf-lifeofcytokinesPleiotropiceffectscancauseunpredictableside-effects第六十二頁,共八十五頁,2022年,8月28日細(xì)胞因子的生物學(xué)檢測檢測方法與原理細(xì)胞增殖或增殖抑制試驗(yàn)細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)胞趨化試驗(yàn)第六十三頁,共八十五頁,2022年,8月28日
檢測中的操作注意要點(diǎn)靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)檢測標(biāo)本的制備顯示檢測結(jié)果2023/1/19第六十四頁,共八十五頁,2022年,8月28日靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)
1、對所測的細(xì)胞因子有特異的敏感性
2、易培養(yǎng)、保存、生物學(xué)特性穩(wěn)定
3、有良好的生長狀態(tài)
4、種屬適配2023/1/19第六十五頁,共八十五頁,2022年,8月28日
各類細(xì)胞因子檢測的常用靶細(xì)胞
細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)干擾因素
IL-1D10(M)增殖法IL-2、IL-4EL-4(M)增殖法IL-4A352(H)增殖抑制法
IL-2CTLL(M)增殖法IL-4IL-3KG-1(H)增殖法
TF-1(H)增殖法GN-CSF、IL-5IL-6、EPOIL-4CTLL(M)增殖法IL-2IL-5BCL-1(M)增殖法IL-4第六十六頁,共八十五頁,2022年,8月28日各類細(xì)胞因子檢測的常用靶細(xì)胞
細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)干擾因素
IL-6B9(M)增殖法IL-4、IL-11BM60(H)增殖法
IL-7Clone-IXN/2b(M)增殖法
IL-8中性粒細(xì)胞(M、H)趨化法
GM-CSFTF-1(H)增殖法IL-3、IL-5IL-6、IL-5TNF/L929(M、H)細(xì)胞毒法
IFNwish(H)病變保護(hù)法IFN-IFN-L929(M)病變保護(hù)法IFN-IFN-
第六十七頁,共八十五頁,2022年,8月28日檢測標(biāo)本的準(zhǔn)備
1、分離特定的產(chǎn)生細(xì)胞
2、對產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)、激活
3、選擇適當(dāng)?shù)氖占瘯r(shí)間2023/1/19第六十八頁,共八十五頁,2022年,8月28日顯示檢測結(jié)果
1、細(xì)胞增殖狀態(tài)的顯示:放射性核素?fù)饺敕?、胞?nèi)酶活性顯示法活細(xì)胞染色法細(xì)胞熒光測定法
2、細(xì)胞毒或細(xì)胞病變狀態(tài)的顯示活細(xì)胞染色法胞內(nèi)酶活性顯示法
DNA斷片測定法2023/1/19第六十九頁,共八十五頁,2022年,8月28日
依賴細(xì)胞株測定法PBMC+PHA培養(yǎng)取上清液
+CTLL-2細(xì)胞培養(yǎng)+MTT培養(yǎng)測OD570值
第七十頁,共八十五頁,2022年,8月28日TNF對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性
TNF對小鼠L929成纖維細(xì)胞株具有細(xì)胞毒活性,細(xì)胞死亡率與TNF生物學(xué)活性成正相關(guān)關(guān)系。結(jié)晶紫染色死細(xì)胞
MTT檢測活細(xì)胞如同時(shí)加用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D,可提高靶細(xì)胞對TNF的敏感性10-100倍。第七十一頁,共八十五頁,2022年,8月28日
濾膜:計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞趨化因子細(xì)胞趨化試驗(yàn)原理示意第七十二頁,共八十五頁,2022年,8月28日
細(xì)胞因子的免疫學(xué)檢測
分泌型細(xì)胞因子的檢測
ELISAELISPOTRT-PCR(分子生物學(xué))細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測
免疫組化技術(shù)第七十三頁,共八十五頁,2022年,8月28日細(xì)胞因子受體的存在形式
膜型細(xì)胞因子受體分泌型細(xì)胞因子受體2023/1/19第七十四頁,共八十五頁,2022年,8月28日細(xì)胞因子受體的檢測方法膜型細(xì)胞因子受體的檢測:配體檢測法抗體檢測法分泌型細(xì)胞因子受體的檢測:標(biāo)記抗體檢測法2023/1/19第七十五頁,共八十五頁,2022年,8月28日
細(xì)胞因子檢測臨床意義細(xì)胞因子正常對照病人疾病年代及受體(pg/ml)(pg/ml)
IL-10.16±0.170.53±0.57腎細(xì)胞癌20030.318.8心絞痛199616±6.738.5±28.8胰腺炎1994IL-22.4±0.810.8±1.8急性缺血性綜合征1999IL-43.34±0.844.05±1.02支氣管高反應(yīng)性2003IL-654.1485.2瘧疾20041.79±2.038.91±13.12腎細(xì)胞癌2002
421620敗血癥20012.1±0.110±1.6風(fēng)濕20002.554.29非酒精性脂肪肝20031.1±0.118.6±2.1原發(fā)性甲狀旁腺功1996
能亢進(jìn)癥
4.34±0.997.3±0.97宮外孕1996
12.3±0.894±12.1類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎19990.3916關(guān)節(jié)炎20041.2±0.610.8±1.8急性缺血性綜合征1999IL-6受體25.1±1(ng/ml)41.7±1.2(ng/ml)原發(fā)性甲狀旁腺功能1996(可溶性)亢進(jìn)癥第七十六頁,共八十五頁,2022年,8月28日
續(xù)表細(xì)胞因子正常對照病人疾病年代及受體(pg/ml)(pg/ml)IL-863331敗血癥20013.843.68非酒精性脂肪肝2003
16.31078±181.5泌尿道感染
1993117.6肝癌20034.8±0.527.5±2.6輕度子宮內(nèi)膜異位癥2003530.2±65.1重度子宮內(nèi)膜異位癥IL-1014.11099.3嚴(yán)重瘧疾20049.2±1.517.7±4.4非小細(xì)胞肺癌200221±4.2轉(zhuǎn)移癌IL-1335.20±12.7092.69±9.87系統(tǒng)性紅斑狼瘡2005IL-1516.2±435±6腹膜炎
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