其它有機酸發(fā)酵工藝衣康酸

其它有機酸發(fā)酵工藝衣康酸第一頁，共四十七頁，2022年，8月28日4．其他有機酸發(fā)酵工藝學4.1衣康酸的發(fā)酵生產(chǎn)概述衣康酸的性質(zhì)和用途衣康酸生產(chǎn)的原理和微生物育種

衣康酸生產(chǎn)方法工藝衣康酸的提取工藝

第二頁，共四十七頁，2022年，8月28日4.1衣康酸的發(fā)酵生產(chǎn)概述衣康酸(Itaconicacid)又稱為甲叉丁二酸、亞甲基琥珀酸最早是由Baup于1836年在研究檸檬酸175℃的熱分解產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)并得到的

20世紀20年代末，日本學者木下廣野鹽水浸漬的酸梅汁中分離出一種能耐高滲透能利用蔗糖、葡萄糖產(chǎn)生衣康酸的青綠色曲霉，并定名為衣康酸曲霉第三頁，共四十七頁，2022年，8月28日20世紀30年代末，Calam、Oxford和Ratajakk等人先后報道了利用土曲霉為菌種將葡萄糖發(fā)酵生成衣康酸，1945年。Lockwood分離出了適合表面培養(yǎng)的土曲霉(Asp.terreus265)，對糖轉(zhuǎn)化率達30%～50%,NRRL1960轉(zhuǎn)化率47.3%。1970年10月，日本靜岡縣磐圖化學公司建立了一座年產(chǎn)1000t衣康酸的工廠，成為當時最大的衣康酸生產(chǎn)公司(該公司目前生產(chǎn)能力為1500t／a。1977年，日本筑波大學應用化學系宣布以木屑水解液為主要碳源，采用土曲霉K26為菌種發(fā)酵制備衣康酸獲得成功，其產(chǎn)量達4.75％，對糖轉(zhuǎn)化率最高可達54.9％20世紀80年代以來．衣康酸的研究得到迅速發(fā)展，更多的微生物如假絲酵母M31、黑曲霉P-1等被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生衣康酸。第四頁，共四十七頁，2022年，8月28日Horitsu等用聚丙烯酰胺凝膠包埋土曲霉生產(chǎn)衣康酸．在連續(xù)的發(fā)酵柱中產(chǎn)酸速率為60mg/h。H．Kautola等以海藻酸鈣凝膠包埋土曲霉NRRL1960的孢子或用CeliteR-626瓊脂凝膠塊固定化菌體，在間歇深層發(fā)酵中最高葡萄糖轉(zhuǎn)化率為54.5％，容積產(chǎn)率是320mg／(L·h)；居乃琥、王孝憲采用固定化土曲霉NRRLl960，以葡萄糖為原料連續(xù)發(fā)酵．利用交替接觸空氣和液體的固定化細胞生物反應器連續(xù)生產(chǎn)衣康酸，最高容積產(chǎn)率為0.73g／g／(L·h)最高衣康酸質(zhì)量濃度為18.2g/L。第五頁，共四十七頁，2022年，8月28日到20世紀90年代末，我國已有10多家衣康酸生產(chǎn)廠我國衣康酸產(chǎn)業(yè)化體系初步形成。1992年，云南天力生物發(fā)酵廠宣布建成國內(nèi)首條年產(chǎn)300t衣康酸生產(chǎn)線。1994年該廠又在此基礎上建成年產(chǎn)2000t衣康酸生產(chǎn)線，以白糖為原料，在300m3氣升式發(fā)酵罐中產(chǎn)酸50g/L以上，對糖轉(zhuǎn)化率大于50％，收率60％，發(fā)酵周期50h。四川成都拉克公司、浙江江山國光生物化工公司、廣東雷州衣康酸公司，第六頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸的性質(zhì)和用途衣康酸的性質(zhì)衣康酸是一種不飽和二元酸，分子式為C5H6O4,分子量為130.1，結構式為：純衣康酸是一種白色粉末狀結晶或無色晶體，熔點167~168℃結晶產(chǎn)品不易吸潮，即使在高溫條件下也不結塊，在真空條件下加熱升華。易溶于水和其他有機溶劑。第七頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸的部分物理化學性質(zhì)性質(zhì)數(shù)值性質(zhì)數(shù)值熔點℃167~168燃燒熱MJ/moL1.98晶體密度Kg/m31.49±0.01生成熱KJ/moL840相對密度Kg/m31.63毒性（LD50）mg/Kg4000水中解離常數(shù)K1=1.50×10-4K2=2.20×10-6第八頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸在水中的溶解度溫度℃溶解度（g/dL）溫度℃溶解度（g/dL）105.95029.2208.36045.9259.57072.62812第九頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸由于分子內(nèi)存在一個不飽和雙鍵和兩個活潑的羧基，使其能夠發(fā)生很多化學反應，其中最重要的是衣康酸的酯化反應。標準的脂化反應能夠產(chǎn)生衣康酸二酯，且產(chǎn)率很高，衣康酸可以和丙烯酸以不同的比例，于80～20℃的水性介質(zhì)中共聚可以制得分子量在500～2，000，000之間的共聚物。衣康酸分子內(nèi)的雙鍵可以和鹵素起定量的加成反應，是測定衣康酸的基礎。衣康酸和胺類反應生成的N-羥基吡咯烷酮是重要的化合物。第十頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸的同分異構體衣康酸有兩種同分異構體，即檸康酸和中康酸，在酸性、中性和弱堿性條件下，衣康酸是穩(wěn)定的。但在強堿性條件下，3種異構體可以相互轉(zhuǎn)化。第十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日4.1.2.2衣康酸的用途

第十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸的用途

（1）衣康酸和丙烯酸共聚物的應用以衣康酸和丙烯酸共聚生成的乳膠可用于皮革的涂層，增加皮革的可塑性，作為汽車、電器涂料，粘著力加強，色澤美觀，不易受外界條件的影響，加入多價金屬氧化物交聯(lián)的衣康酸，丙烯酸制成的牙科粘和劑具有良好的抗壓性能和黏結強度及生理適應性。以不同比例的衣康酸，丙烯酸共聚物可制備多種不同用途的聚合物，如無菌食品包裝材料等。第十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日（2）新型高效除臭劑的應用以衣康酸及其聚合物為原料，添加少量天然物制成的除臭劑反應活性高，依賴于分子內(nèi)活潑的雙鍵和兩個羧基，可以與氨，胺類等堿性惡臭物或硫化氫等酸性惡臭物反應，達到除臭的目的。第十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日（3）在藥物合成中的應用衣康酸與甲苯胺環(huán)縮反應，再用甲醇酯化制成1-(4-甲苯基)-5-氧-3-吡啶羧酸甲酯，在氫硼化鈉作用下生成經(jīng)甲基衍生物，再用甲基磺酰氯酯化生成甲磺酰酯，進一步用經(jīng)基苯甲酸酯進行醚化、皂化、脫酯化等系列反應，可制成4·[11甲基苯基-2-吡咯烷酮-4-基]-甲氧基苯甲酸。該品在生物體內(nèi)與輔酶A酯化，有極強的抑制膽固醇合成酶和脂肪酸合成酶的作用，從而抑制人體內(nèi)的脂肪酸和膽固醇的合成，是預防相治療動脈硬化、糖尿病等多尿病和肥胖病的新藥（4）在紡織行業(yè)的應用無水衣康酸可與蠶絲蛋白中的絲氨酸和羊毛蛋白中賴氨酸、精氨酸及酯氨酸分子反應形成直鏈化合物，對纖維本身無不良影響，可大大改善蛋白質(zhì)纖維的防皺性、耐熱性和熱穩(wěn)定性，而吸濕性顯著降低。第十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日（5）在造紙行業(yè)的應用聚丙烯酰胺稱為標準造紙助劑，衣康酸作為陰性單體合成的聚丙烯酰胺除了可以作為助濾劑以外，還可以作為紙張增強劑，與使用普通的紙張增強劑相比，能夠使紙張強度獲得較大程度的提高，且紙張均勻平整，品質(zhì)優(yōu)良。與丁苯乳膠配制成新型水溶液，用具有較強支持力的白土等作為填充劑，能與紙張形成牢固的膜層，可使紙張變得強韌，并對油墨具有很強的粘著力，使印刷出來的圖案鮮艷美觀。第十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日（6）在其他行業(yè)的應用

衣康酸二雙烷共聚體作為原油的流動點下降劑、可使原油流動溫度由24℃下降至1℃；衣康酸與月桂酸—氨乙基乙醇胺的縮合反應生成咪唑啉衍生物．是生產(chǎn)化妝品的有用試劑；衣康酸與芳香二胺生成的吡咯烷酮衍生物是潤滑劑和增稠劑；與其他各種胺生成的吡咯烷酮衍生物可用于洗滌劑、醫(yī)藥和除草劑之中。衣康酸及其酯類具有廣泛的用途，是化學合成工業(yè)的重要原輔材料．也是化工原料生產(chǎn)中的重要中間體，具有廣泛的開發(fā)前景。第十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日國外衣康酸的消費構成

用途比例%樹脂行業(yè)53化纖行業(yè)17.8離子交換樹脂8鍋爐清洗劑1增塑劑7牙科材料、人造寶石、特種透鏡10.2第十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日時間19951998200020052010需求量（萬噸）2.673.454.055.508.141995~2010年世界衣康酸需求情況預測第十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸生產(chǎn)的原理和微生物育種

.發(fā)酵原理關于衣康酸生物合成途徑已有很多研究，由于研究的菌種、培養(yǎng)方法、檢測手段和分析角度不同，所得的結論也不完全一致。所以衣康酸的生物合成機理至今尚無統(tǒng)一的看法。第二十頁，共四十七頁，2022年，8月28日Bentley等認為，葡萄糖經(jīng)糖酵解(EMP)途經(jīng)和三羧酸循環(huán)(TCA)合成檸檬酸之后．再脫水脫羧生成衣康酸；第二十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日也有人認為可能直接由乙酰CoA和丙酮酸合成檸蘋酸，再由檸蘋酸失水而生成衣康酸；上述兩條途徑實際是交叉的，第一條途徑到檸檬酸時可脫羧形成檸蘋酸而走第二條途徑。因此總的反應式都為：對糖的理論轉(zhuǎn)化率為72%第二十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日Shimt等人認為，乙酸和琥珀酸先縮合成三羧酸，再脫氫脫羧，生成衣康酸。對糖的理論轉(zhuǎn)化率為48%第二十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日從文獻報道來看，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率在40％以上者很多，達50％以上者也不少，從我國中試研究及生產(chǎn)情況來看，轉(zhuǎn)化率均在50％以上。故前兩種途徑占優(yōu)勢的可能性較大。第二十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日發(fā)酵微生物

能產(chǎn)生衣康酸的微生物種類：土曲霉(Asp.terrus)、衣康酸曲霉(Asp．Itaconicus)假絲酵母(Candidaspecies)、紅酵母(Rhodotrorula)、黑粉菌(Ustilagojeae)、桑卷擔菌(Helicobasidiummompa)查爾斯青霉(Penicillumcharlesii)黑曲霉(Asp.niger)。第二十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日第二十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日第二十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日第二十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日第二十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日第三十頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸生產(chǎn)菌誘變選育第三十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日生產(chǎn)衣康酸的微生物篩選法：（1）形態(tài)篩選法根據(jù)以往育種工作的經(jīng)驗，對突變菌落的形態(tài)有針對性地篩選。(2)指示劑顯色法，將誘變株移植在合有0.01％溴甲酚綠指示劑的瓊脂平板上培養(yǎng)，根據(jù)透明圈直徑的大小來篩選突變株。(3)“濃縮”過濾篩選法將經(jīng)誘變的細胞懸浮液移于以衣康酸為惟一碳源的合成培養(yǎng)基中，30-37℃靜置培養(yǎng)18～24h經(jīng)曲層薄宣紙過濾，濾去菌絲，濾液經(jīng)稀釋后在瓊脂平板上分離、篩選。這種方法的主要目的是篩選不能利用衣康酸的突變株，從而提高衣康酸產(chǎn)量。(4)標記篩選法有的科研人員在含1％LiCl抗性平板中篩選出優(yōu)良的菌株。也有人利用單氟乙酸為烏頭酸水合酶的專一性抑制劑，在單氟乙酸抗性平板中挑選出的菌落烏頭酸水合酶活性較高，從而獲得高產(chǎn)衣康酸菌種。第三十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日4.1.4

衣康酸生產(chǎn)方法工藝化學合成法美國Pfizer公司和日本電氣化學公司曾經(jīng)研究開發(fā)以丁二酸酐或丁二酸酯為原料，以不同的催化劑與甲醛反應生成擰康酸，在加熱異構化得到衣康酸。美國Pfizer公司以檸檬酸為原料，在480℃汽化，噴霧進料，以負載的磷酸鹽為催化劑，在290～340℃反應得到檸康酸，轉(zhuǎn)化率達82%，然后加熱220℃異構化得到衣康酸。英國人Calsson等以檸檬酸為原料在250℃高溫，34.5Mpa高壓下反應生成衣康酸和檸康酸，反應的總選擇性超過了90%。第三十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日發(fā)酵法生產(chǎn)

（1）深層分批發(fā)酵工藝

以淀粉為例，深層批發(fā)酵的工藝流程第三十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日在深層批發(fā)酵中重要的工藝參數(shù)包括溫度，pH，接種量，通氣與攪拌速度等。土曲霉對溫度極為敏感，不但會影響衣康酸的積累，而且還會導致產(chǎn)雜酸。土曲霉孢子培養(yǎng)溫度以(33±1)℃最佳；一、二級種子培養(yǎng)溫度以34℃為宜，pH對最終衣康酸的產(chǎn)量起著十分重要的作用。pH在1.8以下時，土曲霉幾乎不能生長和產(chǎn)酸；pH在4.5以上時．菌絲形成較大菌絲球．有時直徑可達5～6mm，同時幾乎不產(chǎn)酸。在菌體生長高峰期應維持pH在3.0左右，以獲得最大生長速率；一旦進入產(chǎn)酸期，應控制pH在2.1～2.3范圍內(nèi)。一級種子接種量保證培養(yǎng)液內(nèi)孢子數(shù)達108～109個／mL為宜，二級種子接菌絲懸浮液12％～14％。在生產(chǎn)中如果通氣不足，則嚴重影響產(chǎn)酸速率及轉(zhuǎn)化風量0.18m3/m3.min,轉(zhuǎn)速80~90r/min.第三十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日（2）固定化細胞發(fā)酵工藝60年代，Kobayashi提出了固定化技術連續(xù)生產(chǎn)衣康酸的發(fā)酵工藝。尤其是進20年來，利用包埋法固定衣康酸生產(chǎn)菌的全細胞生產(chǎn)衣康酸技術的研究比較活躍，固定化土曲霉菌體細胞使用的載體多為聚丙烯酰胺凝膠。1983年Horitsu等人報道了用聚丙烯酰胺凝膠固定土曲霉細胞生產(chǎn)衣康酸的方法，將固定化后的凝膠切成4mm3的碎塊，取40g凝膠裝入和間歇發(fā)酵同樣的反應柱，采用流速4ml/h，35℃通氣1.4L/min連續(xù)發(fā)酵15天后，衣康酸產(chǎn)生速率達到60mg/h,固定化細胞半衰期為10天。第三十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日1986年我國居乃琥等人報道了利用多孔轉(zhuǎn)盤式反應器培養(yǎng)固定化土曲霉菌生產(chǎn)衣康酸的方法。使用的菌種為NRRL1960,在36℃，pH3.0，轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速8r/min,通氣100ml/min的條件下連續(xù)發(fā)酵，流加速度在60ml/h時，衣康酸的產(chǎn)生速率達0.73g/L.h。但到目前為止，固定化細胞發(fā)酵工藝生產(chǎn)衣康酸的技術還僅限于實驗室研究，尚無工業(yè)化生產(chǎn)的報道第三十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日（3）補料分批發(fā)酵工藝根據(jù)衣康酸發(fā)酵過程底物消耗速率和代謝產(chǎn)物合成的關系，可以找出補料發(fā)酵的規(guī)律。例如Asp.terreus54-S-30，在200L氣升式反應器中發(fā)酵，在36～65h階段，衣康酸發(fā)酵進入產(chǎn)酸期，在此階段，衣康酸的容積產(chǎn)率維持在2.3g／(L·h)，糖的消耗速率也恒定在3.9g／(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率維持在60％。通過向培養(yǎng)系統(tǒng)中補充物料，可以使培養(yǎng)液底物濃度較長時間保持在一定范圍，達到延長產(chǎn)酸期的目的。從而提高容積產(chǎn)率、產(chǎn)物濃度和得率。第三十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日衣康酸的提取工藝

濃縮結晶法主要工藝步驟概括為：發(fā)酵液預處理，脫色過濾，濃縮，結晶和重結晶，干燥等幾個步驟。①發(fā)酵液預處理一般加熱溫度為70～75℃；維持15min，可以殺死菌體，防止衣康酸被分解代謝，使蛋白質(zhì)等肢體性物質(zhì)變性凝固，有利于過濾；同時使菌體中的衣康酸釋放出，以提高收率。衣康酸濃度達15％以上時，為了防止衣康酸結晶，必須對過濾設備進行預熱和保溫。第三十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日②脫色過濾過濾主要是利用壓力差為推動力來達到固液分離的目的。在衣康酸生產(chǎn)中通常使用粉狀活性炭，也可使用顆?；钚蕴考懊撋珮渲M行脫色。脫色后的過濾與發(fā)酵醪的過濾有所不同，一是活性炭易穿濾和堵塞濾孔．所以在過濾前必須加入與活性炭等量的助濾劑，以加強過濾效果。常用的助濾劑為硅藻土；二是衣康酸濃度達15％以上時，為了防止衣康酸結晶．必須對過濾設備進行預熱和保溫。③濃縮在常溫下水溶液(或濾液)中衣康酸濃度較低．容易被微生物分解，所以應立即濃縮，不宜停留時間過長。在濃縮過程中溫度不能過高，若在高溫下長時間加熱，衣康酸會發(fā)生部分分解或可能被破壞而變性；同時，殘留在溶液中的其他有機物在高溫下也易分解，使?jié)饪s液色澤加深，粘度增加造成結晶困難，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。濃縮過程中真空度一般要在0.087MPa以上，料溫不超過70℃。蒸汽壓力控制在0.2MPa以下，放料時酸度達40％～45％。第四十頁，共四十七頁，2022年，8月28日④結晶及分離用10℃以下冷凍水降溫，控制溫度在40℃以下結晶?？杉尤牒Y選好的晶種促使結晶。8~12小時后，溫度下降至15以下進行離心分離25~30r/min.⑤干燥衣康酸的干燥是為了去除在晶體表面的游離水，一般70℃沸騰干燥。第四十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日其他提取方法(1)不溶性鹽沉淀法(2)溶劑萃取法(3)離子交換樹脂法(4)膜分離法第四十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日(1)不溶性鹽沉淀法發(fā)酵液經(jīng)過過濾除去菌絲體后，加入適量的PbCO3形成衣康酸鉛沉淀，分離沉淀再加入銨的碳酸鹽溶液，形成的PbCO3

可回收再利用，衣康酸銨濃縮后，通過離子交換樹脂游離出衣康酸，在經(jīng)濃縮結晶，回收衣康酸。第四十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日(2)溶劑萃取法

若發(fā)酵液中含有雜質(zhì)較高時，提取回收衣康酸采用有機溶劑萃取法效果較好。采用乙酸乙酯萃取法，在溶液中加100～200g/kg的氯化鈉，用乙酸乙酯萃取，蒸去溶劑即獲得衣康酸晶體。采用磷酸三丁酯-磺化煤油為萃取劑的方法。目前萃取法提取衣康酸技術尚沒有應用