公開課講課用微生物的實驗室培養(yǎng)

公開課講課用微生物的實驗室培養(yǎng)第一頁，共七十頁，2022年，8月28日到目前為止，幾十項Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎，化學(xué)獎都與微生物學(xué)有關(guān)第二頁，共七十頁，2022年，8月28日微生物的類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌單細(xì)胞的動植物如草履蟲、單細(xì)胞藻類等無細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞細(xì)菌、藍(lán)藻原核細(xì)胞◆微生物的共同特點：個體微小、結(jié)構(gòu)簡單第三頁，共七十頁，2022年，8月28日1.細(xì)菌的形態(tài)第四頁，共七十頁，2022年，8月28日擬核，大型環(huán)狀DNA質(zhì)粒(小型環(huán)狀DNA，含抗生素等抗藥性和固氮的基因)其成分為肽聚糖2.細(xì)菌的結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu)第五頁，共七十頁，2022年，8月28日細(xì)菌主要是以二分裂的方式進(jìn)行增殖（如右圖）3.細(xì)菌的繁殖第六頁，共七十頁，2022年，8月28日芽孢

有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。（抗逆性極強(qiáng)）注：不是繁殖體第七頁，共七十頁，2022年，8月28日例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌.第八頁，共七十頁，2022年，8月28日

真菌是通過產(chǎn)生大量的孢子來繁殖后代的，霉菌的直立菌絲頂端生有孢子，蘑菇的菌褶處也生有孢子，孢子隨風(fēng)飄散，在適宜的環(huán)境條件下，能發(fā)育成一個新個體。單細(xì)胞的酵母菌還可進(jìn)行出芽生殖。孢子生殖和出芽生殖都是無性生殖。

第九頁，共七十頁，2022年，8月28日課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用第十頁，共七十頁，2022年，8月28日培養(yǎng)微生物需要解決的兩個問題是什么？1、為其提供合適的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件2、防止雜菌的入侵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件無菌技術(shù)(獲得純凈培養(yǎng)物）思考:第十一頁，共七十頁，2022年，8月28日1.何為培養(yǎng)基？3.不同的培養(yǎng)基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些營養(yǎng)元素？有何作用？請舉例說明。閱讀教材P14~15相關(guān)內(nèi)容，回答以下問題：

2.按照不同的培養(yǎng)基劃分標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)基有哪些種類、配制特點及其應(yīng)用？一、培養(yǎng)基第十二頁，共七十頁，2022年，8月28日（一）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)1.培養(yǎng)基概念

第十三頁，共七十頁，2022年，8月28日2.培養(yǎng)基的種類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基據(jù)物理性質(zhì)分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基據(jù)化學(xué)成分分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基據(jù)用途分常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于觀察微生物的運動、鑒定菌種用于微生物的分離、計數(shù)用化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)配成如加入血清血漿等根據(jù)細(xì)胞生存所需要的種類和數(shù)量用人工方法模擬合成在培養(yǎng)基中加入（或缺少）某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進(jìn)所需要的微生物的生長。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細(xì)菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細(xì)菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍(lán)，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。含有一般微生物生長繁殖所需要的基本營養(yǎng)物質(zhì)（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）第十四頁，共七十頁，2022年，8月28日液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第十五頁，共七十頁，2022年，8月28日半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)第十六頁，共七十頁，2022年，8月28日固體培養(yǎng)基：菌落第十七頁，共七十頁，2022年，8月28日單個或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體第十八頁，共七十頁，2022年，8月28日幾種菌落及其形態(tài)第十九頁，共七十頁，2022年，8月28日幾種菌落及其形態(tài)第二十頁，共七十頁，2022年，8月28日3.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機(jī)鹽⑴碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-糖類等含碳有機(jī)物質(zhì)

自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-、N2

、NH3牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：有機(jī)C源為異養(yǎng)型微生物提供碳源和能源含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源N2（固氮微生物的唯一氮源）NH3（既是硝化細(xì)菌的氮源又是能源）硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用

不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方第二十一頁，共七十頁，2022年，8月28日特殊營養(yǎng)物質(zhì)：生長因子(3)常見的生長因子：(1)概念：(2)作用：微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物。酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。

一些天然物質(zhì)如酵母膏、蛋白胨、動植物組織提取液等可為微生物提供生長因子（4）來源：第二十二頁，共七十頁，2022年，8月28日注意：最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖最常用的氮源是銨鹽、硝酸鹽對異養(yǎng)生物而言，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如蛋白質(zhì)之所以補(bǔ)充生長因子，是由于缺少合成這些物質(zhì)的酶或合成能力有限第二十三頁，共七十頁，2022年，8月28日此外，還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)（如:生長因子)以及氧氣等的要求。第二十四頁，共七十頁，2022年，8月28日牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g分析營養(yǎng)構(gòu)成？第二十五頁，共七十頁，2022年，8月28日

牛肉膏是用新鮮牛肉經(jīng)過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。牛肉膏主要含有肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機(jī)酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)。此外含硫氨酸較多，而且含有更多的細(xì)菌生長需要的維生素和其它生長因子，是生物制藥發(fā)酵及和種培養(yǎng)基制備的基礎(chǔ)原材料。

蛋白胨是有機(jī)化合物。蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。蛋白胨富含有機(jī)氮化合物，也含有一些維生素和糖類。它可以作為微生物培養(yǎng)基的主要原料，在抗生素、醫(yī)藥工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、生化制品及微生物學(xué)科研等領(lǐng)域中的用量均很大。第二十六頁，共七十頁，2022年，8月28日選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基

不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌（抑制細(xì)菌、放線菌的生長）分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物第二十七頁，共七十頁，2022年，8月28日4.配制原則

⑴目的明確：⑵營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)⑶適宜的pH值：有機(jī)碳源異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑細(xì)菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產(chǎn)科研第二十八頁，共七十頁，2022年，8月28日C課堂練第二十九頁，共七十頁，2022年，8月28日２.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別是()A．碳源B．氮源C．無機(jī)鹽D．特殊營養(yǎng)物質(zhì)A課堂練第三十頁，共七十頁，2022年，8月28日1.何為無菌技術(shù)？無菌技術(shù)包括哪些方面？2.什么是消毒？滅菌？兩者有何區(qū)別？3.常用的消毒與滅菌的方法有哪些？有何要求？4.請說出干熱滅菌法和高壓蒸汽滅菌法的操作步驟。二、無菌技術(shù)閱讀教材P15-P16相關(guān)內(nèi)容，回答以下問題：

第三十一頁，共七十頁，2022年，8月28日獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是什么？二、無菌技術(shù)防止外來雜菌污染1.目的：2.方法：消毒與滅菌消毒與滅菌的概念和區(qū)別？第三十二頁，共七十頁，2022年，8月28日

（１）消毒定義：利用較為溫和的化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。

2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

第三十三頁，共七十頁，2022年，8月28日

（2）滅菌的定義：

以強(qiáng)烈的化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到完全無菌之過程。滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。第三十四頁，共七十頁，2022年，8月28日1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min

或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用70%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法第三十五頁，共七十頁，2022年，8月28日1、灼燒滅菌(2)滅菌的方法：第三十六頁，共七十頁，2022年，8月28日2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.第三十七頁，共七十頁，2022年，8月28日

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好，加棉塞時，應(yīng)使棉塞長度的2／3在試管口內(nèi)，如上圖所示。加棉塞第三十八頁，共七十頁，2022年，8月28日第三十九頁，共七十頁，2022年，8月28日高壓蒸氣滅菌的原理是（）A．高壓使細(xì)菌DNA變性B．高壓使細(xì)菌蛋白質(zhì)凝固變性C．高溫燙死細(xì)菌D．高溫使細(xì)菌DNA變性B第四十頁，共七十頁，2022年，8月28日關(guān)于滅菌和消毒的不正確的理解是A．消毒和滅菌實質(zhì)上是相同的B．滅菌是指殺死環(huán)境中的一切微生物的細(xì)胞、芽孢和孢子C．接種環(huán)用燒灼的方法滅菌D．常用滅菌方法有加熱法、過濾法、紅外線法、化學(xué)藥品法A第四十一頁，共七十頁，2022年，8月28日1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考第四十二頁，共七十頁，2022年，8月28日2.無菌范圍：實驗操作空間消毒操作者的手、衣著消毒實驗用具滅菌實驗操作過程二.無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染1.消毒與滅菌：酒精燈旁操作超凈工作臺第四十三頁，共七十頁，2022年，8月28日三、實驗操作（大腸桿菌的純化培養(yǎng)）（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）第四十四頁，共七十頁，2022年，8月28日1．計算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．6

4．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。5．加塞6．包扎操作步驟第四十五頁，共七十頁，2022年，8月28日包器材第四十六頁，共七十頁，2022年，8月28日包器材第四十七頁，共七十頁，2022年，8月28日7．滅菌:

將裝有培養(yǎng)基的三角錐瓶，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。

8．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.9．無菌檢查：

將滅菌的未接種（或者接種無菌水）的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。第四十八頁，共七十頁，2022年，8月28日第四十九頁，共七十頁，2022年，8月28日（二）純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法微生物的接種技術(shù)：原理：想方設(shè)法在培養(yǎng)基上得到由一個細(xì)菌繁殖而來的肉眼可見的菌落，即獲得較純的菌種。第五十頁，共七十頁，2022年，8月28日涂布器接種環(huán)接種針第五十一頁，共七十頁，2022年，8月28日三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌（目的）⑴平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.接種：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實驗）（空白對照）第五十二頁，共七十頁，2022年，8月28日問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第五十三頁，共七十頁，2022年，8月28日2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。第五十四頁，共七十頁，2022年，8月28日6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液第五十五頁，共七十頁，2022年，8月28日第五十六頁，共七十頁，2022年，8月28日⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼冷涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍第五十七頁，共七十頁，2022年，8月28日問題討論涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。第五十八頁，共七十頁，2022年，8月28日⑴平板劃線法：三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.接種：⑵稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄第五十九頁，共七十頁，2022年，8月28日接種方法的判斷？？？第六十頁，共七十頁，2022年，8月28日四.菌種的保藏：1.臨時保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃第六十一頁，共七十頁，2022年，8月28日本課題知識小結(jié):第六十二頁，共七十頁，2022年，8月28日【典例解析】例:關(guān)于微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是()A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽

D.無機(jī)氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對于D選項，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。D第六十三頁，共七十頁，2022年，8月28日例2：下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是()A.防止雜菌污染

B.消滅雜菌

C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌

D.滅菌必須在接種前解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。B第六十四頁，共七十頁，2022年，8月28日編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入

.（提示：金黃色葡萄球菌具耐鹽性）自養(yǎng)型微生物

含碳有機(jī)物

第六十五頁，共七十頁，2022年，8月28日（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營養(yǎng)