基因重組和基因工程oweroin演示

基因重組和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章目錄第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

DNA重組接合作用(conjugation)轉化作用(transformation)轉導作用

(transduction)轉座

(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)片段重組體（見模型圖左邊產物）：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。

內切酶(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移(recA)

內切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用(conjugation)。可接合質粒如F因子(Ffactor)質?！毦旧w外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子（二二））轉轉化化作作用用通過過自自動動獲獲取取或或人人為為地地供供給給外外源源DNA，，使使細細胞胞或或培培養(yǎng)養(yǎng)的的受受體體細細胞胞獲獲得得新新的的遺遺傳傳表表型型，，稱稱為為轉化化作作用用(transformation)。例：：溶菌菌時時，，裂裂解解的的DNA片片段段被被另另一一細細菌菌攝攝取取。。目錄錄（三三））轉轉導導作作用用當病病毒毒從從被被感感染染的的（（供供體體））細細胞胞釋釋放放出出來來、、再再次次感感染染另另一一（（供供體體））細細胞胞時時，，發(fā)發(fā)生生在在供供體體細細胞胞與與受受體體細細胞胞之之間間的的DNA轉轉移移及及基基因因重重組組即即為為轉導導作作用用(transduction)。λ噬噬菌菌體體的的生生活活史史溶菌菌生生長長途途徑徑(lysispathway)溶源源菌菌生生長長途途徑徑(lysogenicpathway)例目錄錄目錄錄三、、位位點點特特異異重重組組位點點特特異異重重組組(site-specificrecombination)是由由整整合合酶酶催催化化，，在在兩兩個個DNA序序列列的的特特異異位位點點間間發(fā)發(fā)生生的的整整合合。。例（（一））λ噬噬菌菌體體DNA的的整整合合λ噬噬菌菌體體的的整整合合酶酶識識別別噬噬菌菌體體和和宿宿主主染染色色體體的的特特異異靶靶位位點點發(fā)發(fā)生生選選擇擇性性整整合合；；反反轉轉錄錄病病毒毒整整合合酶酶可可特特異異地地識識別別、、整整合合反反轉轉錄錄病病毒毒cDNA的的長末末端端重重復復序序列列(longterminalrepeat,LTR)。例（二二））細細菌菌的的特特異異位位點點重重組組沙門門氏氏菌菌H片片段段倒倒位位決決定定鞭鞭毛毛相相轉轉變變hix為反反向向重重復復序序列列，，它它們們之之間間的的H片片段段可可在在Hin控控制制下下進進行行特特異異位位點點重重組組(倒倒位位)。。H片片段段上上有有兩兩個個啟啟動動子子P，，其其一一驅驅動動hin基因因表表達達，，另另一一正正向向時時驅驅動動H2和和rH1基基因因表表達達，，反反向向(倒倒位位)時時H2和和rH1不不表表達達。。rH1為為H1的的阻阻遏遏蛋蛋白白基基因因。。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏氏菌H片段段倒位位決定定鞭毛毛相轉轉變例（三））免疫疫球蛋蛋白基基因的的重排排免疫球球蛋白白(Ig)，由由兩條條輕鏈鏈(L鏈)和兩兩條重重鏈(H鏈鏈)組組成，，分別別由三三個獨獨立的的基因因族編編碼，，其中中兩個個編碼碼輕鏈鏈(和)，一一個編編碼重重鏈。。輕鏈的的基因因片段段：重鏈的的基因因片段段：LVJCLVDJC重鏈(IgH)基因因的V-D-J重排排和輕輕鏈(IgL)基因因的V-J重排排均發(fā)發(fā)生在在特異異位點點上。。在V片段段的下下游，，J片片段的的上游游以及及D片片段的的兩側側均存存在保保守的的重組組信號號序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重重排的的重組組酶基基因rag(recombinationactivatinggene)共有有兩個個，分分別產產生蛋蛋白質質RAG1和RAG2。。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內內轉酯酯反應應單鏈切切開轉移核核苷酸酸修復、、連接接免疫球球蛋白白基因因重排排過程程目錄錄四、轉轉座重重組由插入入序列列和轉轉座子子介導導的基基因移移位或或重排排稱為為轉座(transposition)。插入序序列(insertionsequences,IS)組成：：二個分分離的的反向向重復復(invertedrepeats,IR)序列列特有的的正向向重復復序列列一個轉轉座酶酶（transposase)編編碼基基因IRTransposaseGeneIR發(fā)生形形式：：保守性性轉座座(conservativetransposition)復制性性轉座座(duplicativetransposition)（一））插入入序列列轉座座插入序序列的的復制制性轉轉座目錄錄轉座子子(transposons)——可可從一一個染染色體體位點點轉移移到另另一位位點的的分散散重復復序列列。轉座子子組成成：反向重重復序序列轉座酶酶編碼碼基因因抗生素素抗性性等有有用的的基因因IRIRTransposaseGene有用基因（二））轉座座子轉轉座由轉座座子介介導的的轉座座目錄錄第二二節(jié)節(jié)重重組組DNA技術DNARecombinationTechnique重組DNA技術術的發(fā)發(fā)展史史年G.J.Mendel的豌豌豆雜雜交試試驗1944年的的肺炎炎球菌菌轉化化實驗驗1973年年美美國國斯坦坦福大大學的的科學學家構構建第一個個重組DNA分子子1977年年美美國國南舊舊金山山由博博耶和和斯旺旺森建建立世世界上上第一家家遺傳工工程公公司，，專門門應用用重組組DNA技技術制制造醫(yī)醫(yī)學上上重要要的藥藥物。。1980年年開開始始建造造第一家家應用重重組DNA技術術生產產胰島島素的的工廠廠1997年年英英國國羅林林研究究所成成功的的克隆隆了多莉相關概概念DNA克隆隆工具酶酶目的基基因基因載載體基本原原理重組DNA技術術與醫(yī)醫(yī)學的的關系系本節(jié)主主要內內容一、重重組DNA技術術相關關概念念克隆(clone)來自同同一始始祖的的相同同副本本或拷拷貝的的集合合。獲取同同一拷拷貝的的過程程稱為為克隆化化(cloning)，即無性繁繁殖。（一））DNA克隆隆技術水水平：：分子克克隆(molecularclone)即DNA克克隆細胞克克隆個體克克?。ǎ▌游镂锘蛑仓参铮〥NA克隆隆應用酶酶學的的方法法，在在體外外將各各種來來源的的遺傳傳物質質（同同源的的或異異源的的、原原核的的或真真核的的、天天然的的或人人工的的DNA））與載載體DNA接合合成一一具有有自我我復制制能力力的DNA分子子———復制制子(replicon)，，繼而而通過過轉化化或轉轉染宿宿主細細胞，，篩選選出含含有目目的基基因的的轉化化子細細胞，，再進進行擴擴增提提取獲獲得大大量同同一DNA分子子，也也稱基因因克克隆隆或或重重組組DNA(recombinantDNA)。生物物技技術術工工程程:基因因工工程程、、蛋蛋白白質質工工程程、、酶酶工工程程、、細細胞胞工工程程等等目的的①分分離離獲獲得得某某一一感感興興趣趣的的基基因因或或DNA②獲獲得得感感興興趣趣基基因因的的表表達達產產物物（（蛋蛋白白質質））基因工程(geneticengineering)——實現基基因克隆所用用的方法及相相關的工作稱稱基因工程，，又稱重組DNA工工藝學。（二）工具酶酶限制性核酸內內切酶DNA聚合酶酶Ⅰ逆轉錄酶T4DNA連連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶TaqDNA聚合酶酶重組DNA技技術中常用的的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內內切酶定義限制性核酸內內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的的特異序列,并在識別別位點或其周周圍切割雙鏈鏈DNA的一一類內切酶。。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用與甲基化酶共共同構成細菌菌的限制修飾飾系統，限制制外源DNA，保護自自身DNA。。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技技術中常用ⅡⅡ型）第一個字母取取自產生該酶酶的細菌屬名名，用大寫；；第二、第三個個字母是該細細菌的種名，，用小寫；第四個字母代代表株；用羅馬數字表表示發(fā)現的先先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌菌d株的第三種酶酶Ⅱ類酶識別序序列特點——回文結構(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口同功異源酶來源不同的限限制酶，但能能識別和切割割同一位點，，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內內切酶雖然識識別序列不完完全相同，但但切割DNA后，產生相相同的粘性末末端，稱為同尾酶。這兩個相同同的粘性末端端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基基因cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（四）基因載載體定義為攜帶帶目的的基因因，實實現其其無性性繁殖殖或表表達有有意義義的蛋蛋白質質所采采用的的一些些DNA分分子。。常用載載體質粒DNA噬菌體體DNA病毒DNA克隆載載體(cloningvector)為使插插入的的外源源DNA序序列被被擴增增而特特意設設計的的載體體稱為為克隆載載體。表達載載體(expressionvector)為使插插入的的外源源DNA序序列可可轉錄錄翻譯譯成多多肽鏈鏈而特特意設設計的的載體體稱為為表達載載體。載體的的選擇擇標準準能自主主復制制；具有兩兩個以以上的的遺傳傳標記記物，，便于于重組組體的的篩選選和鑒鑒定；；有克隆隆位點點（外外源DNA插入入點）），常常具有有多個個單一一酶切切位點點，稱稱為多多克隆隆位點點；分子量量小，，以容容納較較大的的外源源DNA。。1.質質粒粒(plasmid)特點能在宿宿主細細胞內內獨立立自主主復制制；帶帶有某某些遺遺傳信信息,會會賦予予宿主主細胞胞一些些遺傳傳性狀狀。目錄錄λ噬菌菌體DNA改造造系統統λgt系列列（插插入型型，適適用cDNA克克?。〦MBL系系列（（置換換型，，適用用基因因組克克隆））2.噬噬菌菌體(phage)M13噬菌菌體DNA改造造系統統（含含lacZ基因因）M13mp系列列pUC系列列3.粘粘性性質粒粒(cosmid)酵母人人工染染色體體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人人工染染色體體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病病毒DNA改造造的載載體（如腺腺病毒毒，腺腺病毒毒相關關病毒毒，逆逆轉錄錄病毒毒）其他二、重重組DNA技術術基本本原理理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

以質粒為載體的DNA克隆過程目錄（一）目的的基因的獲獲取1.化學學合成法要求：已知知目的基因因的核苷酸酸序列或其其產物的氨氨基酸序列列。2.基因組組DNA文文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫庫(cDNAlibrary)4.聚合合酶鏈反應應(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章）*化學合合成法獲取取目的基因因由已知氨基基酸序列推推測可能的的DNA序序列組織或細胞胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子子的轉化菌菌限制性內切切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化化細胞內由由克隆載體體所攜帶的的所有基因因組DNA的集合*從基因因組DNA文庫獲取取目的基因因目錄限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉錄酶載體受體菌復制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄（三）外源源基因與載載體的連接接1.粘性性末端連接接方式：(1)同同一限制制酶切位位點連接接(2)不不同限制制酶切位位點連接接配伍末端端連接非配伍末末端連接接（二）克克隆載體體的選擇擇和構建建BamHⅠ切割割反應

GGATCCCCTAGGT4DNA連連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制制酶切位位點連接接目錄不同限制制酶切位位點（非非配伍末末端）的的連接EcoRⅠ切割割位點BglⅡ切割割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端端的連接接情況和和同一限限制酶切切位點連連接相似似。目錄2.平平端連接接適用于：：限制性內內切酶切切割產生生的平端端粘端補齊齊或切平平形成的的平端目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3.同同聚物加加尾連接接在末端轉轉移酶(terminaltransferase)的作用下下，在DNA片片段末端端加上同同聚物序序列、制制造出粘粘性末端端，再進進行粘端端連接。。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄4.人工接接頭(linker)連接由平端加上新新的酶切位點點，再用限制制酶切除產生生粘性末端，，而進行粘端端連接。人工接頭及其其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)導入方式轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受受體菌（五）重組體體的篩選1.直接選擇法(1)抗藥性標記選選擇(2)標志志補救(markerrescue)(3)分子子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學學方法如免疫化學方方法及酶免檢檢測分析等(插入失活法法)抗藥性標記選選擇目錄組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油油磷酸脫水酶基因因促進組氨酸合合成λDNA重組體標志補救目錄α互補目錄α互補的檢檢測目錄原位雜交目錄Southern印跡目錄雞的β肌球蛋蛋白的克隆和和檢出目錄重組DNA技技術操作過程程可形象歸納納為小結結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體重組DNA技技術操作的主主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄表達體系的建建立表達載體的構構建受體細胞的建建立表達產物的分分離純化（六）克隆基基因的表達1.原核表表達體系（E.coli表達體系最最為常用）標準：選擇標志強強啟動子翻譯調控序列列 多接頭克克隆位點E.coli表達體系的的不足不宜表達真核核基因組DNA不能加工表達達的真核蛋白白質表達的蛋白質質常形成不溶溶性包涵體(inclusionbody)