羯布羅香種子 超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018羯布羅香種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羯布羅香（Dipterocarpus

turbinatus

Gaertn.f.）種子超低溫保存過(guò)程中的術(shù)語(yǔ)和定義、保存種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于羯布羅香種子的超低溫長(zhǎng)期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測(cè)定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。羯布羅香Dipterocarpus

turbinatus

Gaertn.f.為龍腦香科（Dipterocarpaceae）龍腦香屬（DipterocarpusGaertn.f.）高大喬木，為珍貴用材樹(shù)種，從樹(shù)脂提出的油，商品名為羯布羅香油，油可作調(diào)香劑和定香劑，樹(shù)脂可作藥用，葉用于過(guò)敏性皮炎、刀傷出血。收載于《中華本草第三冊(cè)（1999）》。羯布羅香果實(shí)Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.fruits羯布羅香其堅(jiān)果卵形或長(zhǎng)卵形，密被貼生絨毛；果萼管無(wú)毛，被白色粉霜，增大的2枚花萼裂片為線(xiàn)狀披針形，長(zhǎng)12~15cm，寬約3cm，具1條多分枝的中脈，沿中脈附近具小突起，無(wú)毛。羯布羅香種子Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.seeds羯布羅香的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子褐色，寬卵形，表面粗糙。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過(guò)前處理的羯布羅香種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實(shí)采收5月下旬至6月上旬，花萼變?yōu)樽厣珪r(shí)即可采收，成熟期較短，于一周內(nèi)采收完，去除果翅，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿(mǎn)、均勻、健康的種子，置于10℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過(guò)15d）。切取羯布羅香種胚為保存材料。種子前處理生活力檢測(cè)參照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法檢測(cè)種子生活力。隨機(jī)抽取30粒種子，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，沿種脊小心將種子分成2爿后放培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)側(cè)面向下，滴入TTC溶液浸沒(méi)種子，室溫（25℃）避光放置4h后觀(guān)察染色結(jié)果。生活力計(jì)算直接用肉眼對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀(guān)察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有活力的種子；否則為無(wú)生活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的羯布羅香種子生活力應(yīng)≥90%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹羯布羅香種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為150:1，室溫條件下干燥處理12~26h，在干燥過(guò)程中定期測(cè)定種子含水量，將種子含水量由50%~60%降至45%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測(cè)定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量羯布羅香種子保存量不少于300粒，以便后期的活力檢測(cè)使用。種子冷凍方式羯布羅香種胚超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的羯布羅香種胚放入放入15mL凍存管（每管2粒種子）中，迅速投入液氮中保存。恢復(fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出10個(gè)凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min。凍后種子生活力檢測(cè)取出5管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測(cè)方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測(cè)。當(dāng)種子生活力≥60%時(shí)視為保存成功?；謴?fù)培養(yǎng)將剩下5管解凍后的羯布羅香種胚，播種到MS固體培養(yǎng)基中，溫度28℃～30℃，濕度70%～85%條件下培養(yǎng)。羯布羅香種胚出芽周期大概10～20d。附錄TTC的配制和保存方法精密稱(chēng)取TTC1.00g，溶于100mL磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為1%的TTC溶液，調(diào)pH至6.5~7.5，置棕色瓶?jī)?nèi)4℃