植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲的相關(guān)問題及發(fā)展趨勢,植物保護論文

植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲的相關(guān)問題及發(fā)展趨勢,植物保護論文植物寄生線蟲是重要的植物病原物之一，分布廣，種類多，主要包括根結(jié)線蟲、松材線蟲、大豆孢囊線蟲、莖線蟲及香蕉穿孔線蟲等，據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界每年因寄生線蟲造成的農(nóng)作物經(jīng)濟損踐約在1000億美元以上。長期以來，廣泛使用化學(xué)藥劑對線蟲病害進行防治雖獲得較好的效果，但存在高毒、高殘留的弊端。近年來，隨著人們環(huán)保意識的加強和高毒、高殘留農(nóng)藥的禁用，生物防治日益遭到重視，并且被以為是最具發(fā)展前景的防治手段。為此，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量的研究工作，對植物寄生線蟲有生防潛力的微生物已成為研究的熱門。當前從土壤微生物中分離出的被應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中的生防菌有阿維鏈霉菌、芽孢桿菌、淡紫擬青霉等，且由阿維鏈霉菌開發(fā)的高效、低毒、廣譜的阿維菌素已進行商業(yè)化生產(chǎn)，被廣泛應(yīng)用，發(fā)展前景廣闊。但近年來從土壤微生物中獲得對植物寄生線蟲有生防作用菌株的比例逐年下降，而從另一類較新的微生物類群植物內(nèi)生菌中分離出對植物寄生線蟲有生防作用菌株的研究遭到人們的重視，成為分離獲得植物寄生線蟲生防菌的重要來源。因而，本研究是從植物內(nèi)生菌的分布和種類、分離培養(yǎng)、活性挑選、活性物質(zhì)成分以及防治植物寄生線蟲的作用機理幾方面進行綜述，并對植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲的相關(guān)問題及發(fā)展趨勢進行了討論，以期為深切進入開展相關(guān)研究提供參考。1、分布和種類植物內(nèi)生菌〔Endophyte〕指那些在生活史的某個階段或者全部階段生活在健康植物組織或器官內(nèi)的真菌、細菌或放線菌，被感染的宿主植物不表現(xiàn)外在異常感覺和狀態(tài)。在當前研究過的所有植物中均發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌，它們存在于植物的根、莖、葉、花、果實等各個部位。當前已報道的內(nèi)生細菌超過129種〔從屬于54個屬〕，內(nèi)生真菌到達171個屬，內(nèi)生放線菌主要為鏈霉菌〔Streptomyces〕、鏈輪絲菌〔Streptoverticillum〕、游動放線菌〔Antinoplanes〕、諾卡氏菌〔Nocardia〕、小單胞菌〔Micromonospora〕?？梢?，植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)的分布具有普遍性和多樣性的特點，這為開展植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲的研究提供了有利資源。當前已發(fā)現(xiàn)的具有防治植物寄生線蟲作用的內(nèi)生真菌有尖孢鐮刀菌〔Fusariumoxysporum〕、菜豆擬莖點霉〔Phomopsisphaseoli〕、Melanconiumbetulinum、Geotrichumsp.AL4、球毛殼菌〔Chaetomiumglobosum〕等；內(nèi)生細菌有假單胞菌屬〔Pseudomonassp.〕、嗜麥芽窄食單胞菌〔Stenotrophomonasmaltophilia〕、缺陷短波單胞菌〔Brevundimonasdiminuta〕、枯草芽孢桿菌〔Bacillussubtilis〕等；內(nèi)生放線菌如I07A-01824等。2、分離培養(yǎng)方式方法植物內(nèi)生菌的分離方式方法主要有兩大類：一類為傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方式方法；另一類為新近發(fā)展起來的非培養(yǎng)方式方法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法分離植物內(nèi)生菌有很大的局限性，主要歸因于人們對植物內(nèi)生菌的認識還不夠全面客觀，很多內(nèi)生菌的生長條件還未確定；其次，在挑選經(jīng)過中，受培養(yǎng)基選擇性的限制，很多寄生程度高、與寄主植物密切相關(guān)的固有菌會被漏掉。因而，約有90%-99%的環(huán)境微生物用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法無法進行分離。但由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法能夠得到菌株實體，所以在新物種資源的開掘等方面有著不可替代的作用，還是微生物資源開發(fā)利用的主要方式方法。研究植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性，多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法。由于分離培養(yǎng)法具有局限性，為了獲得盡可能多的內(nèi)生菌，一般采用多種分離培養(yǎng)基對內(nèi)生菌進行分離。當前，國內(nèi)學(xué)者在分離內(nèi)生真菌中常用PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基等，為了抑制細菌和其他雜菌的生長，通常還將選擇性生長抑制劑參加到分離培養(yǎng)基中；分離內(nèi)生細菌常用牛肉膏蛋白胨〔NA〕、Luria-Bertani培養(yǎng)基〔LB〕等；分離放線菌常用高氏一號培養(yǎng)基、黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基等，為防止生長快的菌種阻止或掩蓋生長緩慢菌種，營養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基也常用于分離內(nèi)生菌。在進行植物內(nèi)生菌群落構(gòu)造多樣性研究及種屬鑒定時常用非培養(yǎng)法。3、活性挑選方式方法在植物內(nèi)生菌殺線蟲活性挑選時，一般采用室內(nèi)離體試驗和盆栽測效試驗相結(jié)合的方式方法進行。殺線蟲毒力測定和孵化抑制活性測定主要是觸殺法〔浸漬法〕，即將供試線蟲或卵囊放入已配好的內(nèi)生菌發(fā)酵提取物的藥液中，經(jīng)一定時間處理后，在解剖鏡下檢查線蟲死活和被擊倒的情況或孵化率和線蟲卵的發(fā)育進度。繁衍抑制測定一般采用藥劑培養(yǎng)基法、棉球法和培養(yǎng)基噴霧法，這3種方式方法的不同之處在于藥劑培養(yǎng)基法是將藥劑與培養(yǎng)基混合制成藥劑培養(yǎng)基，然后再往培養(yǎng)基上接種供試線蟲；棉球法是將藥劑和供試線蟲注入培養(yǎng)基的棉球上；而培養(yǎng)基噴霧法是將藥液直接噴霧在接種供試線蟲的培養(yǎng)基上。忌避活性測定一般采用藥劑培養(yǎng)基法和棉球法，這里的藥劑培養(yǎng)基法是將培養(yǎng)基配成一定濃度的藥劑培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基完全凝固后，將藥劑培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基分別從各自中間分開，然后對半互換，在培養(yǎng)基上接種菌株，待菌長滿平板后在分界限的放入脫脂棉球，接種供試線蟲，一定時間后分別取藥劑培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基分離并計線蟲數(shù)；而棉球法是在培養(yǎng)皿的中間和邊緣分別放置脫脂棉球，中間棉球接種線蟲，一邊棉球加藥液，一邊棉球加溶劑做對照，一定時間后分別檢查兩邊棉球上線蟲數(shù)。固然繁衍抑制測定和忌避活性測定都用到了藥劑培養(yǎng)基法和棉球法，但在操作上還是有區(qū)別的。利用藥劑培養(yǎng)基法進行繁衍抑制測定時，培養(yǎng)皿里的藥劑培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基各自是完好的；在進行忌避活性測定時，培養(yǎng)皿里的藥劑培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基分別從各自中間分開，然后對半互換。利用棉球法進行繁衍抑制測定時，是將藥劑和供試線蟲注入培養(yǎng)基的同一個棉球上；在進行忌避活性測定時，是將藥劑和供試線蟲注入培養(yǎng)基的不同棉球上。盆栽試驗一般采用灌根法或浸根法進行研究。灌根法是將一定濃度的內(nèi)生菌發(fā)酵液或菌液灌入植株根區(qū)的一種施藥方式方法；浸根法是將植物根系在一定濃度的內(nèi)生菌發(fā)酵液或菌液中浸泡一定時間后再移栽的一種施藥方式方法。4、活性物質(zhì)成分對植物內(nèi)生菌的研究盡管起步較晚，但發(fā)展很快。植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物繁多，當前已發(fā)現(xiàn)的主要生物活性物質(zhì)有萜類、生物堿、皂苷類、芳香類、苯丙烷類、有機酸類、多肽類等化合物。關(guān)于植物內(nèi)生菌殺線蟲及其活性物質(zhì)的研究固然也獲得了一定進展，但還處于起步階段。一方面，僅有少數(shù)分離自植物內(nèi)生菌的殺線蟲化合物被報道，如乙酸，Pregaliellalactone，3-hydroxypropionicacid，l-〔2，4-dihydroxyphenyl〕-ethanone、1-［〔2R*，4S*，5S*〕-2-chloro-4-methyl-l，3-oxazinan-5-y1］ethanone和1-［〔2R*，4S*，5R*〕-2-chloro-4-methyl-1，3-oxazinan-5-y1］ethanone，ChaetoglobosinA，〔R〕-〔-〕-2-ethylhexan-1-ol和不飽和脂肪酸5，8-二烯十四酸等。另一方面，從桂皮、香蕉、衣索比亞咖啡、黑胡椒、野生大豆等植物中分離出對植物寄生線蟲或卵有毒殺或抑制作用的內(nèi)生菌，但這些內(nèi)生菌殺線蟲活性的有效成分尚不清楚，有待進一步研究。5、防治植物寄生線蟲的作用機理植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲的機理研究當前還不多，因而，對其作用機理還不太清楚，研究者普遍以為主要表如今通過產(chǎn)生殺線蟲活性代謝物質(zhì)影響植物寄生線蟲體內(nèi)各種酶和代謝反響，改變根系分泌物影響植物寄生線蟲的卵孵化以及線蟲的寄生，與植物寄生線蟲競爭營養(yǎng)物質(zhì)和空間位點影響線蟲的侵染，加強宿主植物的抵抗力、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等幾個方面。5.1產(chǎn)生殺線蟲活性代謝化合物線蟲體內(nèi)存在有各種水解酶類、氧化復(fù)原酶和轉(zhuǎn)移酶類等，這些酶對線蟲的生存為害有著重要的作用。多數(shù)內(nèi)生菌對植物寄生線蟲的影響是通過產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)不同酶系和代謝反響的作用而致使線蟲活性下降甚至死亡。李洪濤等初步確定了S506對線蟲的殺傷作用主要是胞外代謝產(chǎn)物。羅紅麗等通過研究鏈霉菌和諾卡氏菌菌株對根結(jié)線蟲卵的寄生率和幼蟲死亡率情況，揣測菌株對根結(jié)線蟲的拮抗機制可能與菌株的代謝活性產(chǎn)物有關(guān)。蠟樣芽孢桿菌〔Bacilluscereus〕能產(chǎn)生胞外蛋白酶，水解包括線蟲角質(zhì)層和膠原等，造成線蟲內(nèi)溶物的泄漏，最終殺死線蟲。有些細菌產(chǎn)生殺線蟲毒素，如蘇云金桿菌〔Bacillusthuringiensis〕在代謝經(jīng)過中產(chǎn)生晶體蛋白毒素，引起線蟲腸內(nèi)膜浸透性增大，進而毀壞線蟲腸道組織，致使線蟲死亡。有些植物內(nèi)生細菌如熒光假單胞菌89B-61〔Pseudomonasfluorescens89B-61〕、泡囊假單胞菌IN884〔BrevundimonasvesicularisIN884〕以及枯草芽孢桿菌的代謝物也能夠防治南方根結(jié)線蟲。5.2改變寄主根系分泌物根系分泌物能影響線蟲卵孵化、線蟲趨向于根的運動、線蟲與寄主的辨別及在根上的寄生與分布。王雪等研究發(fā)現(xiàn)感病大豆品種根系分泌物能刺激胞囊線蟲的孵化，而抗病品種根系分泌物對胞囊線蟲的孵化未表現(xiàn)明顯刺激作用。同時，在研究不同抗性品種根系分泌物對大豆胞囊線蟲二齡幼蟲趨化性的影響時還發(fā)現(xiàn)，感病品種根系分泌物對大豆胞囊線蟲二齡幼蟲表現(xiàn)了明顯的吸引性。通常一些植物寄生線蟲需要寄主植物產(chǎn)生的某種促進卵孵化的因子，而特定根圍的微生物可消耗根系分泌物或改變分泌形式，進而影響這類線蟲的發(fā)育。如WestcotIII等以為，施入銅綠假單胞菌〔Pse-udomonasaeruginosa〕后，小環(huán)線蟲的卵很快會停止發(fā)育，這可能與細菌影響植物根系的分泌物有關(guān)。5.3競爭營養(yǎng)和空間位點具有生防作用的植物內(nèi)生菌施入土壤后，對植物寄生線蟲的作用機制可能與線蟲競爭營養(yǎng)和空間位點有關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)，線蟲與根的互相辨別是根外表的外源凝聚素與線蟲體表糖類之間的互相辨別。也有研究發(fā)現(xiàn)對線蟲有作用的革蘭氏陰性細菌的細胞壁雙層脂膜上具有結(jié)合植物外源凝聚素的構(gòu)造。從以上兩個發(fā)現(xiàn)能夠推斷某些革蘭氏陰性菌可能與線蟲的生態(tài)位部分重疊而發(fā)生兩者之間的競爭排擠，競爭的結(jié)果是革蘭氏陰性菌憑借數(shù)量諸多的優(yōu)勢優(yōu)先占據(jù)線蟲的侵染位點，并在根部定殖，消耗根圍營養(yǎng)，最終占據(jù)空間位點，間接地減少了線蟲侵染率。如Hallmann等研究發(fā)現(xiàn)棉花內(nèi)生細菌與線蟲互相作用經(jīng)過中，有的內(nèi)生細菌在線蟲侵染部位的種群數(shù)量明顯增加，線蟲的侵入可能增加了內(nèi)生細菌的進入位點。5.4誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性植物根際促生菌〔PGPR〕主要通過誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性來防治植物病蟲害，而熒光假單胞菌是一類能夠引起植物系統(tǒng)抗性的主要類群。用熒光假單胞菌P29、P80菌株和芽孢桿菌Bl菌株誘導(dǎo)白三葉草產(chǎn)生對胞囊線蟲〔Heteroderatrifolii〕的系統(tǒng)抗性，能降低雌蟲產(chǎn)卵率或增加雌蟲畸形率。銅綠假單胞菌IE-6S+和CHAO兩菌株能誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生高于對照42％和29％的系統(tǒng)抗性。除此之外，內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌菌株162也能夠誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生抗性，顯著降低南方根結(jié)線蟲的感染率。6、問題與瞻望植物內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中表現(xiàn)出促生、抗病蟲、加強宿主抗性的作用，隨著我們國家對生態(tài)環(huán)境的日益重視，對植物內(nèi)生菌的開發(fā)和廣泛應(yīng)用一定會很快到來。當前，固然在防治植物寄生線蟲方面獲得了一定成效，但在生產(chǎn)實踐中還存在一些問題，主要包括兩個方面：一是具有線蟲生防能力的植物內(nèi)生菌仍然有很多未知的種類需要挖掘，已經(jīng)知道的具有生防潛力的內(nèi)生菌在田間自然條件下定殖能力差。很多植物內(nèi)生菌的生存和培養(yǎng)條件還不清楚，致使大量的內(nèi)生菌無法在實驗室條件下分離培養(yǎng)。大多數(shù)生防菌是在試驗條件下挑選鑒定的，與田間自然條件有很大區(qū)別，這些生防菌在田間施用后往往因定殖能力弱而降低生防效果；另一個是缺乏高效穩(wěn)定的生防菌株。在試驗條件下，有的生防菌的防效不錯，但在田間施用后，由于田間施用、殘留的農(nóng)藥，種群數(shù)量迅速下降而使防效降低；且當前生防菌制劑多為活菌制劑，田間應(yīng)用時常遭到溫度、濕度、土壤pH值等外界因素的影響而使防效不穩(wěn)定。因而，植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲的研究應(yīng)從下面幾個方面努力：第一，擴大對殺線內(nèi)生菌資源種類調(diào)查和挖掘，尤其是加強對具有殺線蟲作用新的植物內(nèi)生菌種類的認識，將更多的內(nèi)生菌資源有效地應(yīng)用于線蟲防治，進一步開