同等學(xué)力串講分子生物學(xué)文老師

1同等學(xué)力臨床醫(yī)學(xué)考試

分子生物學(xué)

（考前串講）第一部分2一、氨基酸（aminoacids）

——組成蛋白質(zhì)的基本單位存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬L-α－氨基酸（甘氨酸除外）。第一章蛋白質(zhì)化學(xué)H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R4甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00纈氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98異亮氨酸

isoleucineIleI

6.02苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非極性疏水性氨基酸5色氨酸

tryptophanTrpW

5.89絲氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTyrY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

蘇氨酸

threonineThrT5.602.極性中性氨基酸6天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22賴氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76組氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.堿性氨基酸7R—CH—COOHNH2R—CH—COO-NH3+R—CH—COOHNH3+R—CH—COO-NH2(pH<pI)(pH=pI)(pH>pI)OH-OH-H+H+pk1pk2

1、兩性解(電)離及等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)—在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢(shì)及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時(shí)溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。氨基酸的理化性質(zhì)8

2、紫外吸收

芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸等）的最大吸收峰在280nm附近（近紫外區(qū)）。芳香族氨基酸的紫外吸收

3、茚三酮反應(yīng)氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成紫色化合物。脯氨酸與茚三酮水合物共熱，可生成黃色化合物。

(微量氨基酸定性或定量分析)9肽鍵（—CO—NH—）是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)鍵

H2N—C—C—OHHR1OR2H—N—C—COOHHHH2N—C—C—HR1OR2N—C—COOHHH+-H2O氨基酸殘基1氨基酸殘基2肽鍵

二、肽鍵和肽

肽鍵（peptidebond）——是由一個(gè)氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。肽(peptide)——是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。

10三、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

二級(jí)結(jié)構(gòu)（種類）三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)

α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲

（二級(jí)與三級(jí)之間）亞層次模體(超二級(jí)結(jié)構(gòu)）

結(jié)構(gòu)域基本結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)11（一）蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)——指多肽鏈中氨基酸的排列順序。主要的化學(xué)鍵：肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。

多肽鏈中氨基酸的排列順序，肽鍵是主要連接鍵。一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。12（二）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。主要化學(xué)鍵：

氫鍵

主要形式：

-螺旋

-折疊-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲13(1)右手螺旋，每圈含3.6個(gè)AA(2)肽鍵平面與螺旋長(zhǎng)軸平行，螺圈之間形成氫鍵(3)R分布在螺旋外側(cè)（脯氨酸可以破壞-螺旋）-螺旋14-折疊-轉(zhuǎn)角

無規(guī)卷曲并非完全“無規(guī)”和“卷曲”，而是有序和穩(wěn)定的，經(jīng)常構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的功能部位。15模體（motif）—通常具有特征性氨基酸序列，由2-3個(gè)在空間相互靠近的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位（如α螺旋、β折疊）組成，形成特定的折疊模式、和蛋白質(zhì)分子的某種功能密切相關(guān)，又稱為超二級(jí)結(jié)構(gòu)。鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體鋅指結(jié)構(gòu)模體是蛋白質(zhì)發(fā)揮特定功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)16纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域

結(jié)構(gòu)域（domain）——在球蛋白分子中，在二級(jí)結(jié)構(gòu)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的獨(dú)立的折疊單位，通常由100-300個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成，并具有一定的生物功能。17（三）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要化學(xué)鍵：疏水鍵離子鍵氫鍵二硫鍵VanderWaals力等。

整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（較大的蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)一般含有兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)域）。N端

C端肌紅蛋白(Mb)18分子伴侶（molecularchaperone）——在蛋白質(zhì)合成時(shí)，未折疊的肽段常需分子伴侶和異構(gòu)酶的協(xié)助，才能正確折疊。在細(xì)胞內(nèi)存在一類蛋白質(zhì)，可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合，隨后松開，引導(dǎo)肽鏈正確折疊，此類蛋白質(zhì)稱為分子伴侶。（熱休克蛋白、Hsp70蛋白）值得注意的是：并非所有的具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子均必須折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)。近年來已發(fā)現(xiàn)近百種天然蛋白質(zhì)分子完全沒有折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，其一級(jí)結(jié)構(gòu)特征是富含親水性氨基酸殘基（特別是帶電荷的氨基酸），而疏水性氨基酸殘基較少，此類蛋白質(zhì)被稱為“天然非折疊蛋白質(zhì)（NUP）”或者“內(nèi)在非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（IUP）”。在全部蛋白質(zhì)分子中，大約30%具有部分非折疊結(jié)構(gòu)。19（四）蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。亞基——是指參與構(gòu)成蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)而又具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈。血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)2021N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)

HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

（一）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)。例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血四、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系22肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)

（二）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

血紅蛋白由4個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基都有一個(gè)血紅素結(jié)合氧，一個(gè)亞基結(jié)合氧可以引起另一個(gè)亞基的構(gòu)象發(fā)生改變，使之更容易結(jié)合氧，此種一個(gè)氧分子與Hb亞基結(jié)合后引起亞基構(gòu)象變化，稱為別構(gòu)效應(yīng)。Hb的氧離曲線呈S形。23（一）蛋白質(zhì)的兩性電離

蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)

——當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。體內(nèi)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)多在pH5.0左右五、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)24兩性解離和等電點(diǎn)H+PCOOHNH3+PCOO-NH3+PCOO-NH2OH-OH-H+陽離子兩性離子陰離子（pH<pI）（pH=pI）（pH>pI）25（二）蛋白質(zhì)的分子大小與形狀分子大小與形狀分子量范圍從大約6000到1000000或更大形狀纖維蛋白（不溶于水）球蛋白（一般溶于水。但膜蛋白是特殊的球蛋白，不溶于水，其疏水性氨基酸殘基側(cè)鏈多伸向外部）26水化膜酸堿酸堿酸堿+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)

等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒脫水作用脫水作用脫水作用（三）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)呈親水膠體的兩個(gè)穩(wěn)定因素：

顆粒表面電荷（雙電層）；水化膜酸堿27（四）蛋白質(zhì)的紫外吸收由于3種芳香族氨基酸殘基（特別是色氨酸和酪氨酸）的存在，蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的紫外光吸收能力，最大吸收波長(zhǎng)為280nm，可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。少量小蛋白質(zhì)或多肽不含有芳香族氨基酸，其紫外光吸收能力來自肽鍵，肽鍵的最大吸收波長(zhǎng)為215nm。利用這一性質(zhì)，可測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的濃度和含量。28（五）蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性蛋白質(zhì)的變性——在某些物理和化學(xué)因素的作用下，維持蛋白質(zhì)特定的空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵被破壞而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變及生物活性的喪失。變性的本質(zhì)：

破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。變性的因素：高溫、高壓、電離輻射、超聲波、紫外線及有機(jī)溶劑、重金屬鹽、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、pH、尿素、SDS、鹽酸胍（6-8mol/L）等。29

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性

蛋白質(zhì)的復(fù)性——若蛋白質(zhì)變性較輕，去除變性因素后，有些蛋白質(zhì)可恢復(fù)或部分恢復(fù)原有構(gòu)象和功能。（六）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顯色劑與蛋白質(zhì)發(fā)生顏色反應(yīng)，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，可用于蛋白質(zhì)的定性和定量分析。常用顯色劑：考馬斯亮藍(lán)、氨基黑等。此外，還有銀染法等。30六、蛋白質(zhì)的分離、純化

蛋白質(zhì)分離與純化的原理主要是依據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)決定的。根據(jù)：1、蛋白質(zhì)的分子大小2、蛋白質(zhì)溶解度的差別3、蛋白質(zhì)帶電荷的不同

4、蛋白質(zhì)對(duì)配體分子的親和力不同31蛋白質(zhì)分離與純化方法比較方法原理種類用途根據(jù)分子大小的純化方法透析法利用透析袋半透膜只允許小分子通過的性質(zhì)，可將蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)與鹽等小分子物質(zhì)分離。透析法除去蛋白質(zhì)中的鹽類、濃縮蛋白質(zhì)超濾法利用壓力或離心力，強(qiáng)行使小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上。超濾法離心利用物質(zhì)密度的不同，經(jīng)離心后，分布于不同的液層而分離。密度梯度離心超速離心*分離純化蛋白質(zhì)*測(cè)分子量凝膠過濾法（分子篩）蛋白質(zhì)混合物通過由凝膠顆粒填充的柱子，大分子蛋白質(zhì)不能進(jìn)入顆粒而先流出，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入顆粒而流出滯后。瓊脂糖(Sepharose)葡聚糖（Sephadex）等*分離純化蛋白質(zhì)*測(cè)分子量*脫鹽利用溶解度差別的純化方法鹽析法破壞蛋白質(zhì)親水膠體的穩(wěn)定因素：雙電層和水化膜，使蛋白沉淀，不同蛋白質(zhì)沉淀時(shí)所需鹽濃度不同。常用中性鹽有：硫酸銨、硫酸鈉等初步分離混合蛋白質(zhì)pI沉淀等電點(diǎn)時(shí)相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀有機(jī)溶劑萃取*有機(jī)溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低，使蛋白質(zhì)的水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀*該方法易使蛋白變性，操作中注意控制條件丙酮、乙醇、異丙醇等低溫、控制有機(jī)溶劑濃度可分離純化蛋白質(zhì)32根據(jù)電荷的不同的純化方法電泳蛋白質(zhì)分子在高于或低于其pI的溶液中帶凈的負(fù)或正電荷，因此在電場(chǎng)中可以移動(dòng)。遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷量以及分子形狀與分子量大小瓊脂糖凝膠電泳SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳雙相電泳等*分離鑒定蛋白質(zhì)*測(cè)亞基分子量離子交換層析在某一pH時(shí)各蛋白質(zhì)所帶電荷不同，根據(jù)與固定相結(jié)合力與洗脫條件不同而分離陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂HPLC分離純化蛋白質(zhì)利用對(duì)配體親和力差異的純化方法親和層析用與蛋白質(zhì)進(jìn)行特異結(jié)合的配基為固相，使流動(dòng)相中能與配基特異結(jié)合的物質(zhì)得到分離濃縮免疫親和層析金屬螯合層析等分離純化蛋白質(zhì)方法原理種類用途33

凝膠層析（分子篩）34

離子交換柱層析35

親和層析36七、蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組（proteome）——是指某種細(xì)胞或組織中基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，包括在不同環(huán)境、不同狀態(tài)或不同發(fā)育階段細(xì)胞蛋白質(zhì)水平的變化。

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)——主要研究各種生物基因組在細(xì)胞中表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用，包括在不同環(huán)境、不同狀態(tài)（正常和癌癥等各種病理狀態(tài)）、不同發(fā)育階段、不同組織細(xì)胞中蛋白質(zhì)分子的種類、結(jié)構(gòu)和功能，以及蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，最終目的是為人類健康服務(wù)，發(fā)現(xiàn)療效高、不良反應(yīng)小的新藥。37一、核酸的化學(xué)組成

98%以上分布于細(xì)胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。10％分布于細(xì)胞核、其余在細(xì)胞質(zhì)。

(DNA)

(RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的基因型。參與細(xì)胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。

第五章核酸化學(xué)38核酸的基本組成單位——核苷酸分子組成有3部分：——堿基：嘌呤堿，嘧啶堿——戊糖：核糖，脫氧核糖——磷酸39核酸的存在部位、功能和化學(xué)組成核酸DNARNA存在部位主要在細(xì)胞核主要在細(xì)胞質(zhì)功能遺傳信息的載體遺傳信息的表達(dá)化學(xué)組成戊糖2-脫氧核糖核糖堿基嘌呤腺嘌呤A、鳥嘌呤G腺嘌呤A、鳥嘌呤G嘧啶胞嘧啶C、胸腺嘧啶T胞嘧啶C、尿嘧啶U磷酸磷酸磷酸40核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。二、核酸的分子結(jié)構(gòu)（一）核酸的基本組成單位——核苷酸41123561'2'3'4'5'415′端3′端核苷酸的連接

核苷酸之間以3',5'磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。CGA5

ACTGCT3人類基因組長(zhǎng)度為3.2×109個(gè)堿基對(duì)（bp），編碼蛋白質(zhì)的基因約有3萬多個(gè)。421.DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)——脫氧核苷酸序列。5′端3′端CGA(二)DNA的分子結(jié)構(gòu)43

2.DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(B型)

DNA分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成，兩鏈以-脫氧核糖-磷酸-為骨架，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤。螺旋直徑為2nm，形成大溝及小溝相間。堿基垂直螺旋軸居雙螺旋內(nèi)側(cè)，與對(duì)側(cè)堿基形成氫鍵配對(duì)-A=T;GC.相鄰堿基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10.4對(duì)堿基。堿基組成-Chargaff

規(guī)則：[A]=

[T]、[G]

[C]以氫鍵配對(duì)44DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性45真核生物染色質(zhì)由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是——核小體。（核小體—是染色質(zhì)的基本組成單位）（DNA：約200bp

組蛋白：H1、H2A，H2B、H3、H4原核細(xì)胞染色體是指大部分遺傳物質(zhì)組成的單一環(huán)形雙鏈DNA分子。46

染色質(zhì)存在：真核細(xì)胞中組成：DNA、組蛋白、非組蛋白形式：常染色質(zhì)、異染色質(zhì)在有絲分裂中期，染色質(zhì)經(jīng)過壓縮可以產(chǎn)生染色體。4.DNA的功能基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。47（三）RNA的分類、結(jié)構(gòu)與功能

RNA的主要功能是控制蛋白質(zhì)的合成。參與蛋白質(zhì)合成的RNA主要有3大類:

信使RNA（mRNA）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）核糖體/核蛋白體RNA（rRNA）占細(xì)胞%3-5%15%80%作用是蛋白質(zhì)合成的模板，其編碼區(qū)中每3個(gè)堿基組成1個(gè)特異的氨基酸密碼子，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)運(yùn)特異的氨基酸和識(shí)別模板mRNA中的密碼子核糖體中的rRNA，是核酶（具有催化功能的RNA），催化肽鍵形成，并且和幾十種蛋白質(zhì)組裝成核糖體，是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所此外:還有一些其他類型的小分子RNA。48SD序列：原核生物mRNA的5'非翻譯區(qū)的一段序列，是核糖體復(fù)合物的形成位點(diǎn).原核mRNA翻譯起始部位有特殊的堿基序列--SD序列

在起始密碼AUG上游7～10個(gè)堿基處有一段富含嘌呤的序列，其共有序列為AGGAGG，稱為SD序列（長(zhǎng)4～6個(gè)堿基）。此處對(duì)于翻譯的正確起始十分重要。1.信使RNA(mRNA)49真核mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.大多數(shù)真核mRNA的5′末端都已7-甲基鳥嘌呤-三磷酸核苷（m7GpppN）為起始結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被稱為帽子結(jié)構(gòu)。它是由鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶加到轉(zhuǎn)錄后的mRNA分子上的。5′帽子結(jié)構(gòu)提供信號(hào)使核糖體小亞基與之結(jié)合，保護(hù)mRNA免受核酸酶降解，并且與成熟的mRNA從核內(nèi)輸送到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。2.帽子結(jié)構(gòu)后面是5′-UTR,編碼區(qū)，3′-UTR，3′末端有polyA尾。3.大多數(shù)真核mRNA的3′末端有一個(gè)含20～

250個(gè)腺苷酸的多聚腺苷酸（polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。（polyA尾不是DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)物，組蛋白沒有polyA尾）。4.polyA尾是真核mRNA成熟的標(biāo)志之一。50hnRNA

內(nèi)含子(intron)mRNA

mRNA成熟過程

外顯子(exon)mRNA

外顯子(exon)mRNA

hnRNA

mRNA

內(nèi)含子(intron)hnRNA

mRNA

外顯子(exon)內(nèi)含子(intron)hnRNA

mRNA

脊椎動(dòng)物、植物和酵母的mRNA起始密碼子及其附近存在保守的共有序列，即Kozak序列。51mRNA的功能

把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯原核細(xì)胞

細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后剪接轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAhnRNA翻譯蛋白質(zhì)真核細(xì)胞

52

tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)—三葉草形氨基酸臂tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)—倒L形tRNA的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。（tRNA含稀有堿基比較多）2、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）53rRNA的結(jié)構(gòu)：一大一小兩個(gè)亞基3、核糖體RNA（rRNA）rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。核糖體大小大、小亞基rRNA蛋白質(zhì)種類原核生物70S50S23S,5S3330S16S21真核生物80S60S28S,5S,5.8S4940S18S33rRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）54動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要的RNA種類及功能細(xì)胞核和胞液線粒體功能核蛋白體RNArRNAmtRNA核蛋白體組成成分(不均一核RNA)hnRNA成熟mRNA的前體信使RNAmRNAmtRNA蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運(yùn)RNAtRNAmtRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸細(xì)胞內(nèi)小RNA核內(nèi)小RNAsnRNA參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)核仁小RNAsnoRNArRNA的加工和修飾胞質(zhì)小RNAscRNA蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成信號(hào)等

55

近年來，廣泛存在于真核生物的微RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA）稱為研究熱門。

微RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約22(約20～25）個(gè)核苷酸的單鏈RNA，是參與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育（時(shí)序）的基因。

小干擾RNA（siRNA）是一類長(zhǎng)21～25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，產(chǎn)生于病毒感染或其他雙鏈RNA誘導(dǎo)以后，其功能是引起特異的靶mRNA降解，以維持基因組穩(wěn)定，保護(hù)基因組免受外源核酸入侵和調(diào)控基因表達(dá)等，這一細(xì)胞反應(yīng)過程稱為RNA干擾（RNAi）。56三、核酸的理化性質(zhì)和應(yīng)用核酸可以被核酸酶水解（限制性內(nèi)切酶是基因工程的工具酶）。核酸在260nm處有最大光吸收。加熱等可以使核酸變性，雙鏈解開，產(chǎn)生增色效應(yīng)。

DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂57

DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。加熱使一半DNA變性時(shí)的溫度稱為融解溫度（熔解溫度），以Tm表示。其大小與G+C含量成正比。DNA的GC含量越高，Tm值越大。58熱變性DNA緩慢冷卻時(shí)，兩條解開的DNA鏈可以恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一復(fù)性過程叫做退火。DNA復(fù)性后，光吸收降低，這一現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。利用不同來源的DNA進(jìn)行退火，如果它們含有互補(bǔ)序列，就可以得到雜交分子，即形成分子雜交。雜交類型：

DNA－DNADNA－RNARNA－RNA59

（二）酶的分子組成和結(jié)構(gòu)

1.單純酶：僅由氨基酸構(gòu)成的酶。如脲酶、淀粉酶、脂酶等

第二章酶學(xué)一、酶的一般特性

（一）概念

1.酶是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)其特異底物具有高效催化作用的蛋白質(zhì)。

2.核酶是具有催化功能的RNA分子。

酶蛋白：決定酶的特異性輔因子小分子有機(jī)物

2.全酶金屬離子輔基:與酶蛋白結(jié)合牢固

輔酶:與酶蛋白結(jié)合疏松

（透析易除去）60由若干空間上相互靠近的氨基酸殘基組成的與酶催化活性直接相關(guān)的區(qū)域。活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)的作用

結(jié)合基團(tuán)－與底物相結(jié)合

催化基團(tuán)－催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物

（調(diào)節(jié)亞基：變構(gòu)酶有）3.酶的活性中心或稱活性部位61（三）酶促反應(yīng)的特點(diǎn)

1.酶易失活（變性）

2.酶的催化效率極高

3.酶對(duì)底物的專一性

4.酶的活性可受到調(diào)控

（四）酶的活力

1.酶活力：是指其催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。

通常利用在一定條件下所催化的反應(yīng)速度表示酶活力大小

2.酶活力單位

⑴概念：在一定條件下和時(shí)間內(nèi)，將一定量的底物轉(zhuǎn)化成

產(chǎn)物所需要的酶量。（U/g或U/ml）

⑵國(guó)際單位(IU)：在最適反應(yīng)條件下（250C），每分鐘催

化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的酶量定義為１個(gè)IU。62

⑶比活力：表示酶的純度。用每毫克蛋白質(zhì)所含酶活力單位數(shù)表示（U/mg）。比活力越大,酶的純度越高。3．轉(zhuǎn)換數(shù)和米氏常數(shù)

⑴轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat）：是酶的催化常數(shù)。其定義為在一定條件下每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)或每秒鐘每微摩爾酶轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)。多數(shù)酶的Kcat范圍是每秒1－104。

⑵米氏常數(shù)（Km）：是酶的特征性常數(shù)。在數(shù)值上等于酶促速度達(dá)到最大速度一半時(shí)的底物濃度(mol/L)。

Km可近似地表示酶與底物親和力的大小。Km越小，酶與底物的親和力越大，所以酶的最適底物的Km最小。63

⑶米氏方程：基于酶反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說，表示底物濃度與酶反應(yīng)速率的定量關(guān)系。v=

⑷Kcat/Km比值：作為酶催化效率的參數(shù)。比值越大，酶的催化效率越高。Vmax[S]Km+[S]64二、酶的催化機(jī)制（一）過渡態(tài)、活化能和結(jié)合能在一個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系中，反應(yīng)物分子的能量有高有低，只有處于較高能量狀態(tài)的活化分子才能進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)酶-底物反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說：E＋SESE＋P過渡態(tài)中間產(chǎn)物ES復(fù)合物的生成，降低了反應(yīng)活化能，因而大大加快反應(yīng)的速度，故其催化效率極高。（二）酶催化作用的機(jī)制在酶促反應(yīng)中，ES復(fù)合物的形成過程，既是專一性的識(shí)別過程，更是分子間反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)的過程，其涉及到多種效應(yīng)。酶催化作用的機(jī)制類型有:鄰近效應(yīng)、一般酸堿催化、親核催化、親電催化、靜電效應(yīng)和誘導(dǎo)契合。多數(shù)酶蛋白在催化過程中同時(shí)利用兩種或兩種以上催化機(jī)制。65反應(yīng)總能量改變

非催化反應(yīng)活化能

酶促反應(yīng)活化能

一般催化劑催化反應(yīng)的活化能能量

反應(yīng)過程底物產(chǎn)物

酶促反應(yīng)活化能的改變活化能：底物分子從初態(tài)轉(zhuǎn)變到活化態(tài)所需的能量。66三、酶活性的調(diào)控多種因素影響酶促反應(yīng)的速度。如：酶濃度、底物的濃度、溫度、pH、抑制劑和激活劑等；同時(shí)，參與酶活性的調(diào)控也有許多環(huán)節(jié)，包括：基因表達(dá)調(diào)控、激素、蛋白酶解激活、反饋抑制、可逆共價(jià)修飾、別構(gòu)調(diào)節(jié)等。67基態(tài)反應(yīng)物在反應(yīng)前的能量狀態(tài)。過渡態(tài)（活化態(tài)）指反應(yīng)物在反應(yīng)途徑中能量最高、最不穩(wěn)定的形式，此時(shí)化學(xué)鍵正在斷裂或形成過程之中?；罨茉谝欢囟认?，1摩爾底物全部進(jìn)入活化狀態(tài)所需的自由能，等于過渡態(tài)和基態(tài)的自由能差（KJ/mol）。結(jié)合能是形成酶-底物復(fù)合物過程中釋放的能量，主要來自酶和底物之間結(jié)合的次級(jí)鍵，每個(gè)次級(jí)鍵的形成都釋放出少量自由能。這是降低酶促反應(yīng)活化能和穩(wěn)定過渡態(tài)的主要能量來源?；鶓B(tài)、過渡態(tài)、活化能和結(jié)合能的概念68常見酶的催化作用機(jī)制類型類型概念（特點(diǎn)、舉例）鄰近效應(yīng)底物與酶形成復(fù)合物后，使反應(yīng)基團(tuán)在空間上相互靠近，而使有效濃度極大升高一般酸堿催化化學(xué)鍵的斷裂和形成需要轉(zhuǎn)移電子。通過某種方式增加反應(yīng)基團(tuán)固有的親核性或親電性，提高其反應(yīng)能力。簡(jiǎn)單的方式就是在反應(yīng)基團(tuán)（如酶活性中心的功能基團(tuán)）上增加或去除一個(gè)質(zhì)子。親核催化（共價(jià)催化）酶利用其富含電子的親核基團(tuán)，攻擊底物缺少電子的親電中心，二者結(jié)合形成共價(jià)中間物。常見酶的親核基團(tuán)有：Ser側(cè)鏈-CH2OH、Cys的-CH2SH、Lys的-NH2和His的咪唑基等。其主要特點(diǎn)是改變了反應(yīng)歷程（生成了共價(jià)中間物），以穩(wěn)定過渡態(tài)。親電催化酶利用其缺少電子的親電體，攻擊底物富含電子的親核中心的酶促反應(yīng)。如很多酶利用其金屬離子（Zn2+，Mg2+等）作為親電體直接參與催化過程。靜電效應(yīng)陽離子過渡態(tài)中的正電荷（如正碳離子），或陰離子過渡態(tài)中的負(fù)電荷（如氧陰離子），可通過酶活性中心帶負(fù)電荷的Asp、Glu側(cè)鏈，或帶正電荷的Arg、Lys側(cè)鏈及金屬離子穩(wěn)定之，此稱為靜電效應(yīng)。誘導(dǎo)契合酶蛋白結(jié)合底物（或抑制劑）時(shí)，其三維結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）發(fā)生變化，不僅使活性中心的功能基團(tuán)獲得必需的空間位置，而且為形成和穩(wěn)定過渡態(tài)提供必要的次級(jí)鍵。69常見的酶活性調(diào)節(jié)方式酶活性調(diào)節(jié)方式概念特點(diǎn)（舉例）共價(jià)修飾不可逆共價(jià)修飾蛋白酶解激活許多酶在細(xì)胞內(nèi)合成后，僅為無活性的前體（酶原），然后通過蛋白酶在特定位點(diǎn)水解去除部分肽段后，變成活性蛋白，又稱酶原的激活。*酶原激活實(shí)際上是酶活性中心形成或暴露的過程。*特點(diǎn)是：不可逆共價(jià)修飾；可在細(xì)胞外進(jìn)行,一般不消耗能量*舉例：消化酶、凝血酶、蛋白激酶以及補(bǔ)體系統(tǒng)等。可逆共價(jià)修飾化學(xué)修飾調(diào)節(jié)某些酶在其它酶催化下，使其肽鏈上的特殊基團(tuán)發(fā)生可逆的共價(jià)修飾，快速改變酶活性，稱為化學(xué)修飾調(diào)節(jié)，或酶共價(jià)修飾調(diào)節(jié)。*主要方式：可逆的磷酸化、腺苷化、甲基化、乙酰化和二硫鍵還原與氧化等。*常見的是可逆磷酸化，通過對(duì)特定的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的-OH磷酸化和去磷酸化。*磷酸化和去磷酸化分別由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成。有的蛋白激酶將ATP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的基因上。

非共價(jià)修飾別構(gòu)調(diào)節(jié)別構(gòu)劑非共價(jià)可逆地結(jié)合在酶的別構(gòu)中心，引起酶蛋白構(gòu)象改變，從而影響酶的活性稱別構(gòu)調(diào)節(jié)。這種酶稱為別構(gòu)酶。*別構(gòu)酶是寡聚酶；由活性中心（結(jié)合并催化底物）和別構(gòu)中心（非共價(jià)結(jié)合別構(gòu)劑）組成。*動(dòng)力學(xué)曲線呈S形，不是米氏方程特有的雙曲線。意義：底物濃度的微小變化可引起反應(yīng)速度發(fā)生巨大的變化，有利于在底物濃度較低時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝反應(yīng)。*別構(gòu)效應(yīng)的概念適用于別構(gòu)酶以外的其它蛋白質(zhì)，典型的例子是血紅蛋白結(jié)合氧的過程。70四、核酶（Ribozyme）

定義：具有催化功能的RNA分子。

類型：類型I和類型II自我剪接內(nèi)含子M1RNA(存在于RNaseP,參與tRNA前體加工) 錘頭核酶（擬病毒和類病毒基因組） 發(fā)卡核酶 丁肝病毒的正、負(fù)鏈RNA VsRNA（線粒體逆轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒） 核糖體大亞基rRNA(肽酰基轉(zhuǎn)移酶活性) gRNA(參與RNA編輯) 某些snRNA(參與真核mRNA前體剪接)

特點(diǎn)：催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征與蛋白酶相似

Km低(RNA與底物結(jié)合的專一性較強(qiáng))

Kcat低(催化速度慢)71基因(gene)——是遺傳物質(zhì)的功能單位，主要存在于染色體上，其編碼的功能產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或RNA?；蚪M(genome)——某一物種擁有的全部遺傳物質(zhì)，從分子意義上說，是指全部的DNA序列。中心法則第六章DNA的生物合成(復(fù)制)與損傷修復(fù)遺傳信息的流向：DNA

RNA

蛋白質(zhì)72復(fù)制(replication)——是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。遺傳信息通過親代DNA分子的復(fù)制傳遞給子代。一、DNA復(fù)制(一)核酸合成的一般規(guī)律1．多數(shù)以DNA鏈為模板鏈，按照堿基互補(bǔ)原則進(jìn)行合成。RNA病毒以RNA鏈為模板鏈。2．核酸合成的方向只有一個(gè)：5’→3’，這一過程需要耗能，能量來自底物NTP（或dNTP）。3．特異的聚合酶催化核酸的生物合成。73（二）染色體DNA復(fù)制的一般特征

1.半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)：

DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板，按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全重新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制是DNA復(fù)制最重要的特征。親代DNA子代DNA復(fù)制742.復(fù)制叉：

雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，在DNA復(fù)制生長(zhǎng)點(diǎn)一般形成呈叉形（或Y形）的結(jié)構(gòu)，稱之為復(fù)制叉。3.雙向復(fù)制：

由一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)形成移動(dòng)方向相反的兩個(gè)復(fù)制叉，這種方式最為普遍。754．半不連續(xù)復(fù)制：

在復(fù)制過程中，DNA一條鏈的合成方向和復(fù)制叉前進(jìn)的方向相同，可以連續(xù)復(fù)制，所合成的鏈稱為前導(dǎo)鏈（leadingstrand）；而另一條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能先合成若干的小片段，這些小片段被稱為岡崎片段(Okazakifragments)，岡崎片段再連接起來，這條新合成的鏈稱為隨從鏈（后隨鏈）（laggingstrand）。這種方式稱為半不連續(xù)復(fù)制。

765．復(fù)制起點(diǎn)：

是指DNA復(fù)制所必需的一段特殊的DNA序列。細(xì)菌、質(zhì)粒、病毒和酵母通常具有比較明顯的復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌和酵母的復(fù)制起點(diǎn)長(zhǎng)約200～300bp。哺乳動(dòng)物染色體的復(fù)制起點(diǎn)，迄今仍未闡明其特征。

復(fù)制子(replicon)：是一個(gè)獨(dú)立的DNA復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制終點(diǎn)在內(nèi)的整個(gè)復(fù)制區(qū)域。細(xì)菌只有一個(gè)復(fù)制子，真核生物有多個(gè)復(fù)制子。復(fù)制子776．引物：

所有DNA聚合酶均不能從游離的核苷酸開始合成DNA鏈，必須利用引物提供自由的3’-OH末端,

通過加入核苷酸使DNA鏈得以延伸。引物的主要形式是RNA，少量的病毒（噬菌體）以DNA或者核苷酸（結(jié)合蛋白質(zhì)）為引物。7．參與DNA復(fù)制的酶：

DNA復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，需要30多種酶和蛋白質(zhì)參與，包括①DNA聚合酶；②解鏈、解旋酶類；③引發(fā)酶；④DNA連接酶等。此外，在復(fù)制的起始、延伸和終止階段均需要其他酶和蛋白因子參與，包括DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶等。78參與DNA復(fù)制的物質(zhì)

模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫DNA-pol其他的酶和蛋白質(zhì)因子798．DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性：

DNA復(fù)制的誤差只有10-10至10-9，以保證物種遺傳的保守性，又能通過變異不斷進(jìn)化。復(fù)制方式：1．多起點(diǎn)雙向（真核生物）2．θ型（大腸桿菌）3．滾環(huán)（病毒和噬菌體）4．D-環(huán)（線粒體）5．2D-環(huán)（葉綠體）80（三）大腸桿菌DNA的復(fù)制復(fù)制的過程起始(initiation)延長(zhǎng)(extension)終止(termination)811、復(fù)制起始：（1）辨認(rèn)起始點(diǎn)，合成引發(fā)體：E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC被DnaA蛋白辨認(rèn)結(jié)合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白結(jié)合于起始點(diǎn)，DNA雙鏈局部被打開，引物酶及其他蛋白加入，形成引發(fā)體（primosome）。（2）形成單鏈：

拓?fù)洚悩?gòu)酶使分子的超螺旋構(gòu)象變化，使DNA分子避免打結(jié)、纏繞等，在復(fù)制全過程中起作用。

解鏈酶的作用是解開雙鏈。

解螺旋酶在蛋白因子的輔助下打開DNA雙鏈。

單鏈結(jié)合蛋白SSB結(jié)合于處于單鏈狀態(tài)模板鏈上；（3）合成引物：

引發(fā)體中的引物酶（引發(fā)酶DnaG）催化合成RNA引物,

引物長(zhǎng)度11-12nt，5’端為pppAG,由引物提供3’-OH基,使復(fù)制開始進(jìn)行。8283842、復(fù)制延長(zhǎng)：（1）復(fù)制方向：一個(gè)起始點(diǎn)oriC，兩個(gè)復(fù)制叉同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制，稱為雙向復(fù)制。

（2）鏈的延長(zhǎng)：在DNApolIII的作用下，使鏈延長(zhǎng)。3、復(fù)制終止：（1）復(fù)制終點(diǎn)：原核生物如E.coli，兩個(gè)復(fù)制叉的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終點(diǎn)。（2）切除引物：由RNA酶切去領(lǐng)頭鏈和隨從鏈中的引物，引物留下的空隙由DNApolI催化自5’→3’

方向延長(zhǎng)填補(bǔ)。（3）DNA連接酶：將兩個(gè)不連續(xù)片段相鄰的5’-P和3’-OH連接起來，成為連續(xù)的子鏈，復(fù)制完成。85555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶復(fù)制的終止：隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接86其他：

1、細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒排斥同一類型質(zhì)粒進(jìn)入同一細(xì)胞，這一特點(diǎn)稱為質(zhì)粒的不相容性。2、反義RNA(antisenseRNA)——能夠互補(bǔ)和雜交于一個(gè)基因特異的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（例如復(fù)制引物或者mRNA），并抑制其功能的RNA分子。87

1、原核生物的DNA聚合酶有三種DNA-polⅠ功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅡ功能：

它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

（在無DNApolI和DNApolIII時(shí)起作用,具有

3’→5’核酸外切酶活性。）DNA-polⅢ功能：是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶（DNA復(fù)制）。

5’→3’聚合活性，3’→5’核酸外切酶活性（四）DNA聚合酶88323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

892、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性(合成引物)。延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制,修復(fù)。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol90DNA聚合酶性質(zhì)比較（均具有5’→3’聚合酶活性）亞基數(shù)目3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性功能原核生物DNA聚合酶I1＋＋切除引物、修復(fù)（切口平移）DNA聚合酶II1＋－修復(fù)DNA聚合酶III≥10＋－復(fù)制（延長(zhǎng)過程）真核生物DNA聚合酶α4－－引物合成DNA聚合酶β1－－修復(fù)DNA聚合酶γ2＋－線粒體DNA復(fù)制DNA聚合酶δ2＋－核DNA復(fù)制DNA聚合酶ε5＋－填補(bǔ)缺口、修復(fù)91（五）端粒和端粒酶

端粒(telomere)——真核生物染色體線性DNA分子末端的特殊結(jié)構(gòu)。由特殊的重復(fù)序列組成；對(duì)染色體的穩(wěn)定性起重要作用，防止后隨鏈最后一個(gè)岡崎片段復(fù)制的不完全。

端粒酶——是一種核糖核蛋白(RNP)，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性。端粒酶以自己的RNA組分為模板，以后隨鏈模板DNA的3’端羥基為引物，合成并延長(zhǎng)后隨鏈。

功能：維持染色體的穩(wěn)定性。維持DNA復(fù)制的完整性。9293（六）DNA復(fù)制的忠實(shí)性

DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制

1.遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2.聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；3.復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能(’5’核酸外切酶活性)。94二、DNA損傷修復(fù)

DNA損傷——是指在生物體生命過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生的任何改變。

引起因素：細(xì)胞內(nèi)部的各種代謝產(chǎn)物；外界的物理、化學(xué)因素和DNA分子本身在復(fù)制過程中發(fā)生的自發(fā)性改變。

修復(fù)機(jī)制：保證遺傳信息的高度穩(wěn)定性。在一定條件下，生物機(jī)體能夠使受到損傷的DNA得到修復(fù)。95（一）直接修復(fù)

類型：光修復(fù)和暗修復(fù)。

機(jī)制：光修復(fù)作用是高度特異的直接修復(fù)方式。光修復(fù)由光修復(fù)酶催化進(jìn)行，此酶被可見光激活，可以分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。96（二）切除修復(fù)（復(fù)制前修復(fù)）

定義：是將DNA分子的損傷部分切除，并以另一股完整的DNA鏈為模板，重新合成被切除的片段，使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。

修復(fù)酶：特異的內(nèi)切酶、外切酶、聚合酶和連接酶

修復(fù)系統(tǒng)分類：原核及真核生物均有兩套切除修復(fù)系統(tǒng)①堿基切除修復(fù)系統(tǒng)②核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)971.堿基切除修復(fù)系統(tǒng)DNA糖苷酶DNA糖苷酶特異識(shí)別DNA中發(fā)生改變的堿基，例如，胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的U,并通過水解將其除去，接著AP核酸內(nèi)切酶迅速識(shí)別這個(gè)丟失堿基的裸露位點(diǎn)，在其5’端切斷磷酸二酯鍵，再由磷酸二酯酶切除脫氧核糖磷酸殘基。最后，由DNA聚合酶和連接酶將缺口修復(fù)。2．核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)98

3.錯(cuò)配修復(fù)在DNA復(fù)制完成以后，依賴模板提供的信息，對(duì)新生鏈上的錯(cuò)配堿基進(jìn)行修復(fù)。錯(cuò)配修復(fù)可以將復(fù)制精確度提高100～1,000倍。步驟：①識(shí)別雙鏈 ②尋找錯(cuò)配堿基 ③切除修復(fù)99（三）重組修復(fù)（復(fù)制后修復(fù)）（四）應(yīng)急反應(yīng)（SOS）從大腸桿菌到真核生物，細(xì)胞都有一種緊急應(yīng)激反應(yīng)（SOS）機(jī)制，這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而DNA保留的錯(cuò)誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長(zhǎng)期的突變。直接修復(fù)、切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)和重組修復(fù)能夠識(shí)別DNA的損傷或錯(cuò)配堿基而加以消除，在它們的修復(fù)過程中并不明顯引入錯(cuò)配堿基,因此屬于避免差錯(cuò)的修復(fù)。100三、反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄）——以RNA為模板、以dNTP為原料、由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA的過程。這一過程剛好與轉(zhuǎn)錄相反，所以被稱為反轉(zhuǎn)錄，這種酶叫作反轉(zhuǎn)錄酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）。

反轉(zhuǎn)錄酶兼有3種酶的活性：

1.RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶 2.DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶 3.RNaseH。逆轉(zhuǎn)錄酶無校對(duì)功能，錯(cuò)配率高。這可能是各種RNA病毒突變率高，不斷出現(xiàn)新病毒株的原因。101逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶DNA-RNA雜化雙鏈RNaseH單鏈DNADNA指導(dǎo)的DNA聚合酶雙鏈DNA102一、轉(zhuǎn)錄（transcription）（一）轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)和中心法則

轉(zhuǎn)錄——生物體以DNA為模板合成RNA的過程。

不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄——雙鏈DNA只有一股單鏈用作轉(zhuǎn)錄模板(模板鏈);而另一股單鏈作為編碼鏈，且模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。第七章RNA生物合成和加工103基因表達(dá)——指基因攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)變成為表型的過程。最常見的基因表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)和多肽，其次是RNA。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步。104復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩股鏈均復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄）原料dNTPNTP酶DDDPDDRP產(chǎn)物子代雙鏈DNAmRNA，tRNA，rRNA配對(duì)A-T，G-CA-U，T-A，G-C注：DDDP是依賴于DNA的DNA聚合酶；DDRP是依賴于DNA的RNA聚合酶

復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的區(qū)別1055′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈（正鏈DNA）模板鏈（負(fù)鏈DNA）mRNA（正鏈RNA）蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯106RNA聚合酶（RNApol）——是以雙鏈DNA的一條鏈為模板，以NTP為原料催化RNA生成的酶。

RNApol不同于DNApol，它無校對(duì)功能，不需引物參與聚合反應(yīng)。

新的RNA鏈的合成方向?yàn)椋?＇→3＇。（二）RNA聚合酶(RNApolymerase,RNApol)RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶

模板單鏈DNA雙鏈DNA引物不需要需要起始啟動(dòng)子起始區(qū)延伸40nt/s900bp/s終止子合成的RNA模板DNA校正功能無有107原核生物的RNA聚合酶注：α2ββ’為核心酶，起催化RNA鏈延長(zhǎng)的作用

有多種(如：70)，識(shí)別不同基因的啟動(dòng)子

亞基分子量亞基數(shù)目功能

α365122決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄β1506181催化功能,形成磷酸二酯鍵β＇1556131結(jié)合DNA模板

702631識(shí)別啟動(dòng)子,辨認(rèn)起始點(diǎn),轉(zhuǎn)錄起始全酶：2+核心酶：2108真核生物的RNA聚合酶種類ⅠⅡⅢ細(xì)胞內(nèi)定位核仁核質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物45SrRNA,加工hnRNA5SrRNAtRNA產(chǎn)生3種rRNAU1-U5snRNAU6snRNA-鵝膏蕈堿耐受極敏感中度敏感利福霉素敏感敏感敏感真核生物RNA-Pol比原核生物RNA-pol復(fù)雜,含13-15個(gè)亞基,分三類核心亞基

共同亞基：3種RNA-pol共有

特異亞基：每種RNA-pol有4-7個(gè)RNA-polⅡ的最大亞基的C端結(jié)構(gòu)域(CTD)：若干個(gè)7肽重復(fù)序列(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工時(shí)期作用。109（三）啟動(dòng)子(promoter)和增強(qiáng)子(enhancer)

順式作用元件：

指能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核酸序列。包括：?jiǎn)?dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和沉默子。順式作用元件通過反式作用因子起作用。

反式作用因子：

指能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的因子。通常是蛋白質(zhì)（如轉(zhuǎn)錄因子），也可能是RNA。反式作用因子直接或間接與順式作用元件相互作用。1101.啟動(dòng)子（promoter）：

是RNApol識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

（1）細(xì)菌啟動(dòng)子特點(diǎn)：

有轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的堿基90%以上是嘌呤。

-10序列

-35序列

分別以-10序列、-35序列為中心，各含6bp，其中富含A/T。原核生物的啟動(dòng)子區(qū)有兩個(gè)高度保守的序列：-35區(qū)的TTGACA序列：RNApol的轉(zhuǎn)錄起始辨認(rèn)位點(diǎn)-10區(qū)的TATAAT（Pribnow盒）序列：為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

-10和-35序列之間保持一定間隔距離

一般為16-18bp，在空間上利于RNApol的結(jié)合。不同的啟動(dòng)子與RNApol的親合力不同，是影響轉(zhuǎn)錄頻率的重要因素。111開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物啟動(dòng)子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)55RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因33112（2）真核生物的啟動(dòng)子特點(diǎn)：

啟動(dòng)子必須與轉(zhuǎn)錄因子（TF）結(jié)合才能被RNA聚合酶識(shí)別與結(jié)合。

真核基因的啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄與調(diào)節(jié)所必需的位點(diǎn)，主要是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。蛋白質(zhì)編碼基因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始上游-100-200bp范圍內(nèi)。分類：

核心啟動(dòng)子：包括TATA盒和起始子。決定轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)

啟動(dòng)子近側(cè)序列元件：位于核心啟動(dòng)子上游約-100bp處。包括GC盒、CAAT盒和OCT(八聚體)

等。決定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率和特異性。注：TATA盒結(jié)合蛋白(TBP)具有結(jié)合TATA盒的作用。

1132、增強(qiáng)子(enhancer)：

定義：是一段DNA序列，其中含有多個(gè)能被反式作用因子識(shí)別與結(jié)合的順式作用元件，能調(diào)控（常為增強(qiáng)）鄰近基因的轉(zhuǎn)錄活性。

部位：一般位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游或下游50kb處，但在基因外或某些內(nèi)含子中也有增強(qiáng)子序列。

特點(diǎn)：增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用與其位置和序列方向無關(guān)。

有些增強(qiáng)子具有組織特異性

有些增強(qiáng)子屬于可誘導(dǎo)增強(qiáng)子

負(fù)增強(qiáng)子(negativeenhancer)又稱沉默子(silencer)對(duì)基因表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。114

TATA盒

CAAT盒

GC盒

增強(qiáng)子順式作用元件

結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列1153、內(nèi)含子（intron）和外顯子(exon):

內(nèi)含子：是存在于結(jié)構(gòu)基因或RNA中能轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的序列。

外顯子：是結(jié)構(gòu)基因或RNA中既能被轉(zhuǎn)錄又能被翻譯的序列。

116（四）轉(zhuǎn)錄因子(TF)

轉(zhuǎn)錄因子——是指RNApol起始轉(zhuǎn)錄需要的輔助因子(蛋白質(zhì))。通常結(jié)合于啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)。轉(zhuǎn)錄因子為反式作用因子的一種。

轉(zhuǎn)錄因子含兩種結(jié)構(gòu)域：

①DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合特異的順式作用元件

有4種模體：螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)鋅指結(jié)構(gòu)(zincfingermotif)亮氨酸拉鏈(leucinezipper)螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix,HLH)

②激活結(jié)構(gòu)域:負(fù)責(zé)與轉(zhuǎn)錄裝置中的其他組分相互作用并激活轉(zhuǎn)錄。117（五）終止子及終止因子

1.終止子：是提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA序列。

2.終止因子：是協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子（蛋白質(zhì)）。

原核生物的終止子有兩種類型：

①不依賴ρ因子的終止子：

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成富含G/C的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)出現(xiàn)寡聚U，使RNA聚合酶脫離模板而終止轉(zhuǎn)錄。

②依賴ρ因子的終止子：

ρ因子與RNA聚合酶相互作用以終止轉(zhuǎn)錄。118RNA生物合成的抑制劑

特點(diǎn)舉例嘌呤和嘧啶類似物*人工合成的堿基類似物，6-巰基嘌呤（堿基類似物）能夠抑制和干擾核酸的合成5-氟尿嘧啶DNA模板功能的抑制劑*與DNA結(jié)合，使DNA失去轉(zhuǎn)錄烷化劑,放線菌素D的模板功能，從而抑制其復(fù)制嵌入染料和轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶抑制劑*抑制革蘭氏陽性菌和結(jié)核分

利福霉素枝桿菌的RNA聚合酶的亞基;抑制真核生物的RNA聚合酶α-鵝膏蕈堿（六）RNA生物合成的抑制劑119二、轉(zhuǎn)錄過程

原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄的區(qū)別

原核生物

真核生物

起始階段①RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合；比原核生物復(fù)雜。②DNA雙鏈解開；啟動(dòng)子由轉(zhuǎn)錄因子所識(shí)別，多種③在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合轉(zhuǎn)錄因子和RNApol在起點(diǎn)上形反應(yīng)形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物成前起始復(fù)合物而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3。

延伸階段①亞基脫落，RNApol核心酶變構(gòu)，過程與原核大致相同。因有核膜與模板結(jié)合松弛，沿DNA模板前移；相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)②在核心酶作用下，NTP不斷聚合，象；RNApol前移處處遇上核小

RNA鏈不斷延長(zhǎng)，核苷酸間以體；可觀察到核小體移位和解聚3’5’磷酸二酯鍵相連?，F(xiàn)象。終止階段①RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來在讀碼框架下游，有一組共同序不再前進(jìn)；列AATAAA，再下游還有相當(dāng)多的②轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落。GT序列，稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)有依賴ρ因子與不依賴ρ因子兩種方式。120121三、轉(zhuǎn)錄后加工

原核生物細(xì)胞無細(xì)胞核膜阻隔，轉(zhuǎn)錄的初始產(chǎn)物加工簡(jiǎn)單而且可邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯。真核生物轉(zhuǎn)錄生成的RNA需加工修飾后，再轉(zhuǎn)入胞液，進(jìn)行翻譯。（空間與時(shí)間存在間隔）122原核生物的轉(zhuǎn)錄后加工rRNA前體tRNA前體mRNA前體①轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（30S）經(jīng)過5’端由RNAaseP切割加工大多不需要加工RNAaseⅢ切割，產(chǎn)生3’端由RNAaseD加工。少數(shù)需核酸內(nèi)切16SrRNA，23SrRNA，包括:酶切割后再翻譯5SrRNA的中間前體；①核酸內(nèi)切酶兩端切斷；②核酸內(nèi)切酶和外切酶加工②核酸外切酶切去3’端及甲基化修飾至成熟。附加序列；③3’端加-CCA-OH；④核苷酸的修飾和異構(gòu)化123真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工注：對(duì)rRNA自我剪切加工的研究中，發(fā)現(xiàn)了“核酶”（Ribozyme），它是具有錘頭型或發(fā)卡型二級(jí)結(jié)構(gòu)并具有催化活性的一類核糖核酸。

rRNA前體tRNA前體mRNA前體核仁是rRNA合成和加工