實驗三微生物的接種、分離純化與培養(yǎng)方法

試驗三 微生物的接種、分別純化與培育方法、純化菌種的方法。試驗內(nèi)容：一、接種將微生物接到適于它生長生殖的人工培育基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。１、接種工具和方法不同，接種針的針尖部常做成不同的外形，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接〔圖３－３〕圖３－３接種和分別工具234.5.玻璃涂棒678.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：１〕這是最常用的接種方法。即在固體培育基外表作來回直線形的移動，就可２〕在爭論霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板外表上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀看、爭論它們的形態(tài)。除三點外，也有一點或多點進展接種的。３〕在保藏厭氧菌種或爭論微生物的動力時常承受此法。做穿刺接種時，用的長。４澆混接種45C左右的固就可長出單個的微生物菌落。５〕涂布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，快速用涂布棒在外表作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。６〕液體接種從固體培育基中將菌洗下，倒入液體培育基中，或者從液體培育物中，用移液管將菌液接至液體培育基中，或從液體培育物中將菌液移至固體培育基中，都可稱為液體接種。７〕注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。８〕活體接種是特地用于培育病毒或其它病原微生物的一種方法，由于病毒必需例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。２、無菌操作培育基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具〔如接種針和吸管等〕在無菌條件下接種含菌材料〔如樣品、菌苔或菌懸液等〕于培育基上，這個過程叫做無菌接種操作。在試驗室檢驗中的各種接種必需是無菌操作。試驗臺面不管是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培育基時利于培育皿內(nèi)平板的厚度保持全都。在試驗臺上方，空氣流淌應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量削減，其四周雜菌也應(yīng)越少越好。為此，必需清掃室內(nèi)，關(guān)閉試驗室的門窗，并用消毒劑進展空氣消毒處理，盡可能地削減雜菌的數(shù)量?？諝庵械碾s菌在氣流小的狀況下，隨著灰塵落下，所以接種時，翻開培育皿的時間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必需經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅〔接種柄，一邊轉(zhuǎn)動一邊漸漸地來回通過火焰三次〕，冷卻，先接觸一下培育基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，快速地接種到的培育基上。〔圖３－４〕然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端漸漸通過火焰滅菌，復原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培育皿的蓋翻開一小部分進展接種。在向培育皿內(nèi)倒培育基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。圖３－４斜面接種時的無菌操作(2(3(4(5(6)塞好棉塞二、分別純化含有一種以上的微生物培育物稱為混和培育物〔Mixedculture〕。假設(shè)在一個菌落中全部細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培育〔Pureculture〕１、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取肯定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的養(yǎng)分瓊脂培育基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培育皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培育。單一細胞經(jīng)過屢次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數(shù)次，便可得到純培育物。〔a〕圖３－５傾注平板法〔a〕涂布平板法〔b〕圖解12.熔化的培育基34.無菌水２、涂布平板法個菌落。〔b〕３、平板劃線法線。劃線的方法很多，常見的比較簡潔消滅單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、〔圖３－６〕當接種環(huán)在培育基外表上往后移動時，接種環(huán)上的菌液漸漸稀釋，最終在所劃的線上分散著單個細胞，經(jīng)培育，每一個細胞長成一個菌落?！矆D３－７〕４、富集培育法富集培育法的方法和原理格外簡潔。我們可以制造一些條件只讓所需的微生物生長，在這生物。所制造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在一樣的培育基和培育條件下，經(jīng)過屢次重復移種，最終富集的菌株很簡潔在固體培育基上長出單菌落。假設(shè)要分別一些專性寄生菌，就必需把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過屢次重復移種便可以得到純的寄生菌。圖３－６平板劃線分別法2.曲線法345.四格法５、厭氧法在試驗室中，為了分別某些厭氧菌，可以利用裝有原培育基的試管作為培育容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培育基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進展接種。接種后，參加無菌的石蠟于培育基外表，使培育基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利NCO2 2

取代培育基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分別某些厭三、培育微生物的生長，除了受本身的遺傳特性打算外，還受到很多外界因素的影響，如養(yǎng)分物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類不同，培育的方式和條件也不盡一樣。１、影響微生物生長的因素微生物的生長，除了受本身的遺傳特性打算外，還受到外界很多因素的影響。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。1)養(yǎng)分物濃度細菌的生長率與養(yǎng)分物的濃度有關(guān):μ=μmax*C/(K+C)養(yǎng)分物濃度與生長率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。K值是細菌生長的很根本的特性常數(shù)。它的數(shù)值很小，說明細菌所需要的養(yǎng)分濃度格外之低，所以在自然界中，它們處處生長。然而養(yǎng)分太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死另一方面，隨著養(yǎng)分物濃度的增加，生長率愈接近最大值。２〕溫度在肯定的溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點內(nèi)，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處于最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至會死亡。超過最高生長溫度，微生物也要停頓生長，溫度過高。也會死亡。一依據(jù)微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型：a.嗜冷微生物：其是適生長溫度多數(shù)在-10℃－20℃之間b.中溫微生物：其最適生長溫度一般在20℃－45℃之間c.嗜熱微生物：生長溫度在45℃以上。３〕水分水分是微生物進展生長的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當?shù)乃只钚詤^(qū)域。４〕氧氣依據(jù)微生物對氧氣的需要狀況，可將它們分為以下五個類型。a.需氧微生物這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生微生物都屬于這個類型。兼性需氧微生物罷了。在無氧氣存在的條件下，它進展發(fā)酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。微量需氧微生物這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。耐氧微生物這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會被氧氣所殺死。c.厭氧微生物就是被殺死。２、培育方法1〕依據(jù)培育時是否需要氧氣，可分為好氧培育和厭氧培育兩大類。好氧培育：也稱“好氣培育”。就是說這種微生物在培育時，需要有氧氣參加，否則就不能生長良好。在試驗室中，斜面培育是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培育多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。厭氧培育：也稱“厭氣培育”。這類微生物在培育時，不需要氧氣參與。在厭氧微生物的培育過程中，最重要的一點就是要除去培育基中的氧氣。一般可承受以下幾種方法：降低培育基中的氧化復原電位：常將復原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，參加到培育基中，便可到達目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦參加到培育基中，也可適合厭氧菌的生長?；先パ酰哼@也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸取氧氣；用磷吸取氧氣；用好氧菌與厭氧混合培育吸取氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸取氧氣；用產(chǎn)生氫氣