實(shí)驗(yàn)三微生物的接種、分離純化與培養(yǎng)方法

試驗(yàn)三 微生物的接種、分別純化與培育方法、純化菌種的方法。試驗(yàn)內(nèi)容：一、接種將微生物接到適于它生長(zhǎng)生殖的人工培育基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。１、接種工具和方法不同，接種針的針尖部常做成不同的外形，有刀形、耙形等之分。有時(shí)滴管、吸管也可作為接〔圖３－３〕圖３－３接種和分別工具234.5.玻璃涂棒678.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：１〕這是最常用的接種方法。即在固體培育基外表作來(lái)回直線(xiàn)形的移動(dòng)，就可２〕在爭(zhēng)論霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板外表上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀看、爭(zhēng)論它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)展接種的。３〕在保藏厭氧菌種或爭(zhēng)論微生物的動(dòng)力時(shí)常承受此法。做穿刺接種時(shí)，用的長(zhǎng)。４澆混接種45C左右的固就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。５〕涂布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，快速用涂布棒在外表作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落。６〕液體接種從固體培育基中將菌洗下，倒入液體培育基中，或者從液體培育物中，用移液管將菌液接至液體培育基中，或從液體培育物中將菌液移至固體培育基中，都可稱(chēng)為液體接種。７〕注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預(yù)防某些疾病。８〕活體接種是特地用于培育病毒或其它病原微生物的一種方法，由于病毒必需例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。２、無(wú)菌操作培育基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具〔如接種針和吸管等〕在無(wú)菌條件下接種含菌材料〔如樣品、菌苔或菌懸液等〕于培育基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在試驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必需是無(wú)菌操作。試驗(yàn)臺(tái)面不管是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培育基時(shí)利于培育皿內(nèi)平板的厚度保持全都。在試驗(yàn)臺(tái)上方，空氣流淌應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量削減，其四周雜菌也應(yīng)越少越好。為此，必需清掃室內(nèi)，關(guān)閉試驗(yàn)室的門(mén)窗，并用消毒劑進(jìn)展空氣消毒處理，盡可能地削減雜菌的數(shù)量?？諝庵械碾s菌在氣流小的狀況下，隨著灰塵落下，所以接種時(shí)，翻開(kāi)培育皿的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必需經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅〔接種柄，一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊漸漸地來(lái)回通過(guò)火焰三次〕，冷卻，先接觸一下培育基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來(lái)挑取含菌材料或菌體，快速地接種到的培育基上。〔圖３－４〕然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端漸漸通過(guò)火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時(shí)，通常把平板的面傾斜，把培育皿的蓋翻開(kāi)一小部分進(jìn)展接種。在向培育皿內(nèi)倒培育基或接種時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過(guò)。圖３－４斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作(2(3(4(5(6)塞好棉塞二、分別純化含有一種以上的微生物培育物稱(chēng)為混和培育物〔Mixedculture〕。假設(shè)在一個(gè)菌落中全部細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱(chēng)為純培育〔Pureculture〕１、傾注平板法首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋?zhuān)】隙康南♂屢号c熔化好的保持在40~50°左右的養(yǎng)分瓊脂培育基充分混合，然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培育皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培育。單一細(xì)胞經(jīng)過(guò)屢次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培育物?！瞐〕圖３－５傾注平板法〔a〕涂布平板法〔b〕圖解12.熔化的培育基34.無(wú)菌水２、涂布平板法個(gè)菌落?！瞓〕３、平板劃線(xiàn)法線(xiàn)。劃線(xiàn)的方法很多，常見(jiàn)的比較簡(jiǎn)潔消滅單個(gè)菌落的劃線(xiàn)方法有斜線(xiàn)法、曲線(xiàn)法、方格法、〔圖３－６〕當(dāng)接種環(huán)在培育基外表上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液漸漸稀釋?zhuān)罱K在所劃的線(xiàn)上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培育，每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落。〔圖３－７〕４、富集培育法富集培育法的方法和原理格外簡(jiǎn)潔。我們可以制造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這生物。所制造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在一樣的培育基和培育條件下，經(jīng)過(guò)屢次重復(fù)移種，最終富集的菌株很簡(jiǎn)潔在固體培育基上長(zhǎng)出單菌落。假設(shè)要分別一些專(zhuān)性寄生菌，就必需把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。通過(guò)屢次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。圖３－６平板劃線(xiàn)分別法2.曲線(xiàn)法345.四格法５、厭氧法在試驗(yàn)室中，為了分別某些厭氧菌，可以利用裝有原培育基的試管作為培育容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培育基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)展接種。接種后，參加無(wú)菌的石蠟于培育基外表，使培育基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利NCO2 2

取代培育基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分別某些厭三、培育微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性打算外，還受到很多外界因素的影響，如養(yǎng)分物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類(lèi)不同，培育的方式和條件也不盡一樣。１、影響微生物生長(zhǎng)的因素微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性打算外，還受到外界很多因素的影響。影響微生物生長(zhǎng)的因素很多，簡(jiǎn)要介紹如下。1)養(yǎng)分物濃度細(xì)菌的生長(zhǎng)率與養(yǎng)分物的濃度有關(guān):μ=μmax*C/(K+C)養(yǎng)分物濃度與生長(zhǎng)率的關(guān)系曲線(xiàn)是典型的雙曲線(xiàn)。K值是細(xì)菌生長(zhǎng)的很根本的特性常數(shù)。它的數(shù)值很小，說(shuō)明細(xì)菌所需要的養(yǎng)分濃度格外之低，所以在自然界中，它們處處生長(zhǎng)。然而養(yǎng)分太低時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)就會(huì)遇到困難，甚至還會(huì)死另一方面，隨著養(yǎng)分物濃度的增加，生長(zhǎng)率愈接近最大值。２〕溫度在肯定的溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)：最低生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度。在生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)內(nèi)，微生物都能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速率不一樣。微生物只有處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)速度才最快，代時(shí)最短。超過(guò)最低生長(zhǎng)溫度，微生物不會(huì)生長(zhǎng)，溫度太低，甚至?xí)劳觥３^(guò)最高生長(zhǎng)溫度，微生物也要停頓生長(zhǎng)，溫度過(guò)高。也會(huì)死亡。一依據(jù)微生物最適生長(zhǎng)溫度的不同，可將它們分為三個(gè)類(lèi)型：a.嗜冷微生物：其是適生長(zhǎng)溫度多數(shù)在-10℃－20℃之間b.中溫微生物：其最適生長(zhǎng)溫度一般在20℃－45℃之間c.嗜熱微生物：生長(zhǎng)溫度在45℃以上。３〕水分水分是微生物進(jìn)展生長(zhǎng)的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長(zhǎng)，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長(zhǎng)發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。４〕氧氣依據(jù)微生物對(duì)氧氣的需要狀況，可將它們分為以下五個(gè)類(lèi)型。a.需氧微生物這類(lèi)微生物需要氧氣供呼吸之用。沒(méi)有氧氣，便不能生長(zhǎng)，但是高濃度的氧氣對(duì)需氧微生微生物都屬于這個(gè)類(lèi)型。兼性需氧微生物罷了。在無(wú)氧氣存在的條件下，它進(jìn)展發(fā)酵作用，例如酵母菌的無(wú)氧乙醇發(fā)酵。微量需氧微生物這類(lèi)菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長(zhǎng)最好。這可能是由一它們含有在強(qiáng)氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。耐氧微生物這類(lèi)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會(huì)被氧氣所殺死。c.厭氧微生物就是被殺死。２、培育方法1〕依據(jù)培育時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培育和厭氧培育兩大類(lèi)。好氧培育：也稱(chēng)“好氣培育”。就是說(shuō)這種微生物在培育時(shí)，需要有氧氣參加，否則就不能生長(zhǎng)良好。在試驗(yàn)室中，斜面培育是通過(guò)棉花塞從外界獲得無(wú)菌的空氣。三角燒瓶液體培育多數(shù)是通過(guò)搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。厭氧培育：也稱(chēng)“厭氣培育”。這類(lèi)微生物在培育時(shí)，不需要氧氣參與。在厭氧微生物的培育過(guò)程中，最重要的一點(diǎn)就是要除去培育基中的氧氣。一般可承受以下幾種方法：降低培育基中的氧化復(fù)原電位：常將復(fù)原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，參加到培育基中，便可到達(dá)目的。有的將一些動(dòng)物的死的或活的組織如牛心、羊腦參加到培育基中，也可適合厭氧菌的生長(zhǎng)?；先パ酰哼@也有很多方法，主要有：用焦性沒(méi)食子酸吸取氧氣；用磷吸取氧氣；用好氧菌與厭氧混合培育吸取氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸取氧氣；用產(chǎn)生氫氣