病毒標(biāo)本采集和核酸檢測(cè)技術(shù)指南10-18-16

PAGEPAGE9病毒標(biāo)本采集和核酸檢測(cè)技術(shù)指南為指導(dǎo)各級(jí)醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和其他相關(guān)機(jī)構(gòu)規(guī)范開(kāi)展肺炎標(biāo)本采集與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，確保檢測(cè)質(zhì)量，提高檢測(cè)效率，特制定本指南。一、標(biāo)本采集（一）采集對(duì)象。以及可能被污染的環(huán)境或物品等。（二）采樣人員基本要求。從事標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)經(jīng)過(guò)生物安全和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)（三）標(biāo)本采集基本要求。的密接在住院、隔離觀察或健康監(jiān)測(cè)期間應(yīng)“單采單檢”，即單獨(dú)采集個(gè)體的標(biāo)本，單管進(jìn)行核酸檢測(cè)，不得進(jìn)行混采混檢。（四）采集標(biāo)本種類。（上呼吸道標(biāo)本：包括鼻咽拭子、口咽拭子等。便標(biāo)本/10（花生大小如果不便于留取便標(biāo)本，可采集肛拭子。5mlEDTA凝劑的真空釆血管采集血液。7）采集，第二份血清應(yīng)當(dāng)在發(fā)病后3～45ml2～3ml。其它：已有唾液等標(biāo)本用于病毒檢測(cè)的報(bào)告。（五）標(biāo)本采集和處理。（2～3ml（332～3ml（3ml（亦可用小兒導(dǎo)尿管50ml）。3ml采樣液的采樣管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測(cè)前2～3ml1。使用時(shí)將儲(chǔ)存液用去離子水稀釋至1g/LK表1痰液消化液儲(chǔ)存液配方成分 質(zhì)量/體積二硫蘇醇 0.1g氯化鈉 氯化磷 磷酸氫鈉 磷酸二鉀 0.02g水PH值7.4±0.2（25℃） 7.5ml支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm）5ml50ml肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過(guò)口或鼻經(jīng)過(guò)咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣30～50ml100～250ml300ml。1ml3～51052HANK’S患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，則留取糞便標(biāo)本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。表2 糞便標(biāo)本處理液配方成分質(zhì)量/體積Tris1.211g氯化鈉8.5g無(wú)水氯化鈣（或含結(jié)晶水的氯化鈣）1.1g（1.47g）水800ml用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.5，以去離子水補(bǔ)充至1000ml3～5cm，3～5ml15mlEDTA5ml，根據(jù)所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或1500～2000rpm105ml，301500～2000rpm10物體表面標(biāo)本：參考《農(nóng)貿(mào)（集貿(mào)）環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（WS/T776—2021）充分浸潤(rùn)病毒保存液后在表面重復(fù)涂抹，將拭子放回采樣管浸3進(jìn)行多點(diǎn)分布式采樣。富集濃縮和核酸檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)》（WS/T799-2022），300ml?？筛鶕?jù)現(xiàn)場(chǎng)條件和檢測(cè)需求確定水樣采集方式，如瞬時(shí)水樣（采樣點(diǎn)位某一時(shí)間隨機(jī)采集的樣本）或混合水樣（同一采樣點(diǎn)位不同時(shí)間所采集的瞬時(shí)水樣混合后的樣本）；如農(nóng)貿(mào)（集貿(mào)）市場(chǎng)內(nèi)排水溝內(nèi)無(wú)法采集足夠體積水樣，可采集污水的拭子標(biāo)本，參考《農(nóng)貿(mào)（集貿(mào)）市場(chǎng)環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（WS/T776-2021）推薦的方法，用拭子浸入吸附污水，將拭子3個(gè)污水采樣位置應(yīng)進(jìn)行多點(diǎn)分布式采樣。其他材料：如唾液等標(biāo)本，依據(jù)檢測(cè)需求采集。（六）標(biāo)本包裝。標(biāo)本采集后應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝。及采樣日期。涉及外部標(biāo)本運(yùn)輸?shù)?，?yīng)根據(jù)標(biāo)本類型，按照AB類感染性物質(zhì)進(jìn)行三層包裝。（七）標(biāo)本保存。用于病毒分離和核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)當(dāng)盡244℃（2℃～8℃）保存；2470℃或以下保存（如無(wú)-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）4℃320℃以下可長(zhǎng)期保存。境外高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域人群以及肺炎患者的密切接觸者等人員的核酸檢測(cè)標(biāo)本，檢測(cè)后，應(yīng)當(dāng)在-2074℃保存24（八）標(biāo)本送檢。標(biāo)本采集后應(yīng)當(dāng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本采集后室溫（25℃）放置不宜超過(guò)4小時(shí)。如果需要長(zhǎng)途運(yùn)輸，應(yīng)采用干冰保藏，難以獲取干冰時(shí)，可使用冰袋、冰排等低溫運(yùn)輸。1.送檢標(biāo)本。各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）發(fā)現(xiàn)的本土疫情中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵病例、感染來(lái)源不明的本土病例、境外輸入病例、入境物品及相關(guān)環(huán)212-1）。各省分離到的新的代表性毒株，應(yīng)及時(shí)送中國(guó)疾控中心病毒病所復(fù)核、保藏。2.標(biāo)本及毒株運(yùn)輸。AUN2814，包裝符合國(guó)際民Doc9284《危險(xiǎn)物品安全航空運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的PI620BUN3373Doc9284《危險(xiǎn)物品安全航空運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的PI650（毒）種或標(biāo)本運(yùn)輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號(hào)）辦理《準(zhǔn)運(yùn)證書(shū)》。國(guó)際運(yùn)輸。在國(guó)際間運(yùn)輸?shù)牟《緲?biāo)本或毒株，理相關(guān)手續(xù)，并滿足相關(guān)國(guó)家和國(guó)際相關(guān)要求。抵達(dá)目的地機(jī)場(chǎng)后，由專業(yè)運(yùn)輸車輛運(yùn)送至接收單位，通過(guò)陸路運(yùn)輸?shù)臉?biāo)本由專業(yè)車輛進(jìn)行運(yùn)送，運(yùn)送人員和接收人員應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行雙簽收。毒株的來(lái)源、種類、數(shù)量，編號(hào)登記，采取有效措施確保毒株和標(biāo)本的安全，嚴(yán)防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。二、病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)PAGEPAGE16（一）檢測(cè)人員要求。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員應(yīng)當(dāng)具有實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)歷以及相關(guān)專業(yè)技術(shù)技能，接受過(guò)病毒相關(guān)檢驗(yàn)檢測(cè)技能培訓(xùn)。檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)按照所開(kāi)展檢測(cè)項(xiàng)目及標(biāo)本量配備實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員，以保證及時(shí)、高效完成檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告。（二）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。1.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)病毒核酸。位置的不同，可分為集中布置形式和分散布置形式。開(kāi)展病毒核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。如采用標(biāo)本加樣、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。集中布置形式的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置應(yīng)遵循“各區(qū)獨(dú)立，單向流動(dòng)（注意風(fēng)向，壓力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原則。各區(qū)的功能如下：①試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)：用于分裝、儲(chǔ)存試劑、制備擴(kuò)增反應(yīng)混合液，以及儲(chǔ)存和準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)耗材。該區(qū)應(yīng)配備冰箱或冰柜、離心機(jī)、試驗(yàn)臺(tái)、渦旋振蕩器、微量加樣器等。為防止污染，該區(qū)宜保持正壓狀態(tài)。②標(biāo)本制備區(qū)：標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)桶的開(kāi)啟、標(biāo)本滅活（必要時(shí)）、核酸提取及模板加入至擴(kuò)增反應(yīng)管等。該區(qū)應(yīng)配備冰箱或冰柜、生物安全柜、離心機(jī)、試驗(yàn)臺(tái)、微量加樣器，可根據(jù)實(shí)際工作需要選配自動(dòng)化核酸提取儀等。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)桶的開(kāi)啟、分裝應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成。為防止污染，該區(qū)宜保持負(fù)壓狀態(tài)。為操作方便，標(biāo)本的分裝以及核酸提取也可以在獨(dú)立的生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，提取的核酸可以轉(zhuǎn)運(yùn)至該區(qū)加至擴(kuò)增反應(yīng)液中。③核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)：進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物分析。該區(qū)應(yīng)配備實(shí)時(shí)熒光定量PCR該區(qū)宜保持負(fù)壓狀態(tài)，壓力等于或低于標(biāo)本制備區(qū)。RT-PCRSOP本后，應(yīng)當(dāng)在生物安全柜內(nèi)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行清點(diǎn)核對(duì)，并依據(jù)SOP進(jìn)行試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本前處理、核酸提取、核酸擴(kuò)增、結(jié)果分析及報(bào)告。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立可疑標(biāo)本復(fù)檢的流程。①試劑準(zhǔn)備。應(yīng)當(dāng)選擇國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的試劑，建議根據(jù)核酸提取試劑及擴(kuò)增體系的要求選擇配套的標(biāo)本采樣管，不建議免提取核酸直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。②標(biāo)本處理。使用含胍鹽等滅活型采樣液的標(biāo)本無(wú)需進(jìn)行滅活處理，可直接進(jìn)行核酸提取，而使用非滅活型采樣液的標(biāo)本，按照核酸提取試劑盒的說(shuō)明，取適量標(biāo)本加至核酸提取裂解液中充分混勻作用一定的時(shí)間則可以有效滅活病毒。選用熱951556℃30污水水樣標(biāo)本處理可參考《污水中富集濃縮和核酸檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)》（WS/T799-2022）推薦的方法；污水拭子標(biāo)本處理可參考《農(nóng)貿(mào)（集貿(mào)）市場(chǎng)環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（WS/T776-2021）推薦的方法。③核酸提取。將滅活后的標(biāo)本取出，在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)標(biāo)本采集管加樣，或按照核酸提取試劑盒的說(shuō)明，將標(biāo)本與裂解液作用足夠時(shí)間后繼續(xù)核酸提取步驟，核酸提取完成后立即封蓋。取適量核酸加至PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中。PCR可開(kāi)蓋，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高壓，按一般醫(yī)療廢物轉(zhuǎn)移出實(shí)驗(yàn)室處理。檢測(cè)機(jī)構(gòu)所選用的病毒核酸檢測(cè)試劑應(yīng)針對(duì)病毒基因組中開(kāi)放讀碼框1ab（openreadingframe1ab，ORF1ab）和核衣殼蛋白（nucleocapsidprotein，N）基因，人體標(biāo)本檢測(cè)原則上選擇含內(nèi)源性內(nèi)參的核酸檢測(cè)試劑。⑤陽(yáng)性標(biāo)本的確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽(yáng)性病例需滿足以下兩個(gè)條件中的一個(gè)：2（ORF1ab、N）RT-PCR條件二：兩種標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽(yáng)性，或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢測(cè)中均出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，可判定為陽(yáng)性。環(huán)境與生物材料核酸檢測(cè)陽(yáng)性要排除疫苗接種物殘留污染的影響。核酸檢測(cè)結(jié)果假陰性的可能原因包括：標(biāo)本質(zhì)量差；標(biāo)本采集時(shí)間過(guò)早或過(guò)晚；標(biāo)本保存、運(yùn)輸和處理不當(dāng)；其他原因如病毒變異、PCR抑制等。⑥質(zhì)控。由上級(jí)疾控部門對(duì)下級(jí)疾控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸檢測(cè)質(zhì)控考核，中國(guó)疾控中心每年至少開(kāi)展一次對(duì)省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控考核，并同時(shí)提供全國(guó)病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)控方案，省級(jí)針對(duì)地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控考核每年不少于兩次。各檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)核酸檢測(cè)質(zhì)量控制，選用擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒指定的核酸提取試劑和擴(kuò)增儀。性能驗(yàn)證。臨床標(biāo)本檢測(cè)前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)核酸提取試劑、提取儀、擴(kuò)增試劑、擴(kuò)增儀等組成的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行必要的性能驗(yàn)證，性能指標(biāo)包括但不限于精密度（至少要有重復(fù)性）和最低檢測(cè)限。室內(nèi)質(zhì)控。實(shí)驗(yàn)室可按照《國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展核酸檢測(cè)有關(guān)要求的通知》（國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕53）要求規(guī)范開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)控。每批檢測(cè)至少有1（1.5-3倍）、3份陰性質(zhì)控品（生理鹽水）。質(zhì)控品隨機(jī)放在臨床標(biāo)本中，參與從提取到擴(kuò)增的全過(guò)程。大規(guī)模人群篩查時(shí)，一旦出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本采用另外一到兩種更為靈敏的核酸檢測(cè)試劑對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，復(fù)核陽(yáng)性方可報(bào)出。物品和環(huán)境標(biāo)本的采集檢測(cè)，還需在采樣前及采樣過(guò)程中至少設(shè)一個(gè)現(xiàn)場(chǎng)空白標(biāo)本及一個(gè)運(yùn)輸空白標(biāo)本，以進(jìn)行過(guò)程中的質(zhì)量控制。室間質(zhì)評(píng)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)常態(tài)化參加國(guó)家級(jí)或省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)組織的室間質(zhì)評(píng)。對(duì)檢測(cè)量大以及承擔(dān)重點(diǎn)人群篩查等任務(wù)的實(shí)驗(yàn)室，可適當(dāng)增加室間質(zhì)評(píng)頻率。不按要求參加室間質(zhì)評(píng)的，或室間質(zhì)評(píng)結(jié)果不合格的，應(yīng)通報(bào)批評(píng)并上報(bào)國(guó)家衛(wèi)健委，待室間質(zhì)評(píng)通過(guò)后方可開(kāi)展核酸檢測(cè)。核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)《國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于加強(qiáng)疾控機(jī)構(gòu)病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的通知》（國(guó)衛(wèi)辦疾控函〔2021〕548號(hào)）《疾控機(jī)構(gòu)病毒核酸檢測(cè)質(zhì)量控制方案》。供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為流調(diào)溯源工作提供支持。測(cè)序標(biāo)本選取原則。結(jié)合流調(diào)信息和病例傳播鏈關(guān)系，Ct32中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵病例、感染來(lái)源不明的本土病例、境外輸入病例、入境物品及相關(guān)環(huán)境陽(yáng)性標(biāo)本、疫苗接種后核酸檢測(cè)陽(yáng)性者標(biāo)本等。測(cè)序結(jié)果應(yīng)與本地近一個(gè)月的輸入病例和本土病例序列進(jìn)行比對(duì)。對(duì)同一傳播鏈或流行病學(xué)關(guān)系明確的病例無(wú)需全部測(cè)序。測(cè)序要求。①測(cè)序單位和流程。以省、自治區(qū)、直轄市為單位確定開(kāi)展病毒全基因組測(cè)序的機(jī)構(gòu)，包括省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)和科研機(jī)24作。不具備測(cè)序條件的省份要及時(shí)將標(biāo)本送至病毒病所，病毒病所收到標(biāo)本后及時(shí)啟動(dòng)序列測(cè)定工作。②結(jié)果報(bào)告與反饋。各省份要建立本省輸入、本土病例病毒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，及時(shí)進(jìn)行序列比對(duì)分析，逐步提高自主分析能力。獲得的全部測(cè)序數(shù)據(jù)都必須上報(bào)中國(guó)疾控中心病毒病所用于我國(guó)病毒溯源數(shù)據(jù)庫(kù)的更新與維護(hù)。對(duì)本土疫情的指示或首發(fā)病例、本土疫情中由不同基因型的毒株導(dǎo)致的新2448結(jié)果；對(duì)本土疫情中歸屬已知傳播鏈的病例、境外輸入病例、環(huán)境標(biāo)本（非指示或首發(fā)病例相關(guān)），測(cè)序數(shù)據(jù)于每周周一上午集中上報(bào)，病毒病所確認(rèn)數(shù)據(jù)完整無(wú)誤后于一周之內(nèi)反饋結(jié)果。血清抗體檢測(cè)。血清抗體檢測(cè)用作病毒核酸檢測(cè)的補(bǔ)充檢測(cè)，也用于評(píng)估疫苗接種后誘發(fā)的免疫反應(yīng)。應(yīng)采用中國(guó)藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的試劑進(jìn)行檢測(cè)，采集急性期（發(fā)病7天內(nèi)）和恢復(fù)期（3-4周后）雙份血清進(jìn)行檢測(cè)，也可根據(jù)臨床需要確定采集時(shí)間，疑似病毒感染者抗體檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)應(yīng)排除疫苗接種因素的影響。病毒分離培養(yǎng)。Ct309696毒病所保存?zhèn)浒福⒍局晷蛄械认嚓P(guān)信息報(bào)送病毒病所。不489696抗原檢測(cè)。不具備開(kāi)展核酸檢測(cè)條件的基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)、隔離觀察人員和有抗原自我檢測(cè)需求的社區(qū)居民可以進(jìn)行抗原檢測(cè)?？乖瓩z測(cè)不作為確診病例或無(wú)癥狀感染者診斷的依據(jù)，僅用作核酸檢測(cè)方法的補(bǔ)充，實(shí)現(xiàn)“快篩快檢”，提高感染者發(fā)現(xiàn)的及時(shí)性。具體實(shí)施流程及要求參照《病毒抗原檢測(cè)應(yīng)用方案（試行）》（聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制綜發(fā)﹝2022﹞21）執(zhí)行。三、實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)Th物安全要求根據(jù)病毒傳播特性、致病性和臨床資料等信息，該病毒按照第二類病原微生物進(jìn)行管理，具體要求如下：（一）實(shí)驗(yàn)活動(dòng)規(guī)范。病毒培養(yǎng)、動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)在生物安全三級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展；未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作應(yīng)當(dāng)在生物安全二級(jí)及以上