瓊脂糖凝膠電泳

DNA/RNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)；分離、鑒定和提純核酸首選的標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)制備凝膠的材料:

瓊脂糖電泳凝膠電泳聚丙烯酰胺電泳一、實(shí)驗(yàn)原理（1）某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳的速率，電泳的速率與核酸分子大小和構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構(gòu)型快于松散型開(kāi)環(huán)分子或線(xiàn)性分子，從而可以分離大小不同的DNA或RNA分子。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。

（2）瓊脂糖是一種線(xiàn)性多糖聚合物，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。分離長(zhǎng)度凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳200bp—近50kb聚丙烯酰胺凝膠電泳5—500bp分辨率高

采用不同濃度的凝膠可以分辨范圍廣泛的DNA分子。含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍

凝膠中的瓊脂糖含量[%（W/V）]DNA/RNA分子的分離范圍（kb）0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—320.1—2二、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑質(zhì)粒樣品、酶切樣品和PCR樣品。凝膠電泳系統(tǒng)和電泳圖像分析系統(tǒng)(凝膠成像系統(tǒng))等。瓊脂糖、

1XTAE電泳緩沖液、溴化乙錠、

6X載樣緩沖液（

6Xloadingbuffer）和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等。凝膠電泳系統(tǒng)DYY-6C型

雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源（北京六一）輸出范圍（顯示分辨率）：6-600V(1V)

4-400mA

(1mA)

240W

美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)小型水平電泳槽Mini-SubCellGTCell

凝膠成像分析系統(tǒng)DNAMarker一個(gè)已知分子質(zhì)量的DNA樣品做對(duì)照，用來(lái)確定待測(cè)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。常用電泳緩沖液緩沖液緩沖容量遷移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度復(fù)雜DNA混合物；超螺旋DNATBE很高較慢低分子量高價(jià)格昂貴，不常用TPETris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）DNA的泳動(dòng)受到電泳緩沖液和離子濃度的影響。缺乏離子，電導(dǎo)率嚴(yán)重降低，電泳遷移率很慢；離子強(qiáng)度過(guò)高，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量的熱能，最嚴(yán)重的結(jié)果是凝膠熔化，DNA變性。常用的電泳緩沖液有TAE，TPE和TBE，其中TAE的緩沖容量最低，長(zhǎng)時(shí)間電泳將被消耗。上樣緩沖液電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。EB染料

溴化乙錠（EB）是一種高度靈敏的熒光染色劑，它在標(biāo)準(zhǔn)的302mm紫外光照射下能發(fā)射橙紅色信號(hào)，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射下檢測(cè)瓊脂糖中的DNA。

EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡(jiǎn)便，快速，室溫下15-20min；不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出，效果較好；可以加到樣品中或膠中。EB是誘變劑，有劇毒，使用時(shí)一定要戴手套，且一定要注意等到瓊脂糖涼到四十多度的時(shí)候再加EB，否則EB有一定的揮發(fā)性，而鼻黏膜對(duì)EB的吸收是較明顯的。EB廢液要經(jīng)過(guò)凈化處理再行棄置。SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，但操作不便，信號(hào)不穩(wěn)定，易猝滅，價(jià)格較昂貴。Goldview:主要成分吖啶橙，高毒，在相當(dāng)程度導(dǎo)致細(xì)胞凋忘。較便宜，但效果不及EB。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.制備瓊脂糖凝膠（1%）2.制備凝膠板3.加樣4.電泳5.染色6.結(jié)果觀(guān)察

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．50×TAE的稀釋?zhuān)喝缰苽?0mL1×TAE，取1mL50×TAE加入49mL水定容至50mL。2．制備1%的瓊脂糖膠液：取0.2g瓊脂糖溶于20mLTAE中，在短時(shí)間里加熱瓊脂糖全部熔化，使溶液冷卻至40℃.(加入濃度為10mg/mL的EB2μL，使EB的終濃度為1μg/mL)。3．用于RNA電泳的電泳槽用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥后灌滿(mǎn)3%的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用DEPC—SDW沖洗電泳槽，梳子同樣處理。4．用膠帶封住膠床，放好梳子。5．將溫?zé)岘傊堑谷肽z床中，凝膠的厚度在3—5mm之間，凝固20—60min。6．在凝膠完全凝固之后，小心移去梳子，將膠床放在電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑極）。7．向電泳槽中注入適量的TAE緩沖液，通常緩沖液高于膠面1cm。8．分別將DNA/RNA樣品與加樣緩沖液混合,用移液槍將樣品加入加樣孔。9．正確連接電泳槽和電源，設(shè)定穩(wěn)壓為75V，電流一般為50mA。10．電泳結(jié)束后，在紫外觀(guān)測(cè)儀上進(jìn)行觀(guān)察。四、注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧制膠和加樣過(guò)程中要防止氣泡的產(chǎn)生。紫外光對(duì)人眼有害，觀(guān)察時(shí)加蓋玻璃罩，觀(guān)察時(shí)間不宜太長(zhǎng)。EB具有強(qiáng)誘變性，可致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。加樣時(shí)，Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或DNA帶型不整齊。配膠和灌電泳槽需使用同一批緩沖液。因?yàn)閜H或離子強(qiáng)度很小的差別也會(huì)在凝膠前部造成紊亂，影響DNA片段的泳動(dòng)。梳板的選用一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板，梳齒寬厚，形成的點(diǎn)樣容積較大，用于DNA片段回收實(shí)驗(yàn)等；相反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。一般來(lái)說(shuō)，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠，此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。

跑出好看的電泳圖凝膠一定要加熱熔解完全，均勻，可以對(duì)著光亮的地方看看清澈不清澈；一般情況下，梳子越薄而長(zhǎng)，條帶越好看；