2 動物生物制品的制備

第二章

動物生物制品的制備第一節(jié)一般生物制品的制備方法一、原料的選擇、預處理和保存方法1.原料的選則

生物原料可來源于人體、動物、植物、微生物及海洋生物的生物組織或分泌物，也可以來源于人工構建的工程細菌、工程細胞及人工免疫的動植物1.原料的選則（1）.注意事項：注意最佳生長時期（2）.選擇原料時應遵循的原則：原料來源豐富，產地接近，成本低；原料新鮮雜質含量少，起始原料質量穩(wěn)定2、原料的預處理生物材料動物材料植物材料微生物材料3.原料的保存方法1）冷凍2）有機溶劑脫水3）防腐劑保鮮二、目的產物的提取1.組織細胞破碎高壓勻漿高速珠磨超聲破碎壓力法反復凍融化學滲透酶溶破碎2.固液分離離心雙水分配膜過濾微濾超濾反滲透

三、.目的產物的分離純化在去除各種雜質的同時將目的產品成分進行富集與濃縮純度、提純倍數、收獲率分級沉淀、超濾、電泳、層析……第二節(jié)各類生物制品的分離純化方法一、蛋白質類制品的分離純化方法1.根據蛋白質的分子大小、形狀和密度差異進行的分離純化（1）.過濾和超過率技術（2）.離心和超離心技術（3）.凝膠過濾層析技術（4）.透析2.利用蛋白質電性進行分離純化（1）.等電點沉淀（2）.離子交換層析技術（3）.電泳和等點聚焦電泳3、利用蛋白質的親水性和疏水性進行分離（1）.鹽析技術（2）.乙醇和聚乙二醇沉淀法（3）.疏水層析法4.利用蛋白質的化學性質分離純化（1）.辛酸沉淀法（2）.利凡諾沉淀法（3）.固相化染料柱層析（4）.螯合柱層析二、核酸類制品的分離純化方法1.提取環(huán)烷酸2.對提取的核酸制品進行純化

1）.鹽析法及沉淀法2）.離心法

3）.膜分離法三、多糖的分離純化方法四.脂類的分離純化方法第三節(jié)強毒菌(毒)種的選育

病原分離純粹試驗致病性免疫原性

篩選出適用毒株，分裝，凍干保存三、弱毒菌(毒)種選育傳統(tǒng)方法培育弱毒活疫苗種和病毒種

利用病原自然弱毒株

LaSota、牛痘、鴿痘經典方法誘變弱毒株選育化學途徑：亞硝酸基胍物理途徑：熱、干燥、射線等生物途徑：適應非易感動物適應細胞雜交減毒第四節(jié)細菌增殖技術一、細菌繁殖規(guī)律與生長條件細菌的營養(yǎng)：水、碳、氮、鹽類、生長因子等細菌生長的條件：氣體、溫度、PH值、滲透壓細菌繁殖規(guī)律：二分裂法遲緩期、對數增殖期、穩(wěn)定期、衰退期二、細菌的分離與培養(yǎng)需氧菌的分離培養(yǎng)1．平板分離培養(yǎng)法：平板劃線分離培養(yǎng)法、傾注培養(yǎng)法2．需氧芽胞菌的分離培養(yǎng)法3．利用化學藥品抑茵的分離培養(yǎng)4．通過實驗動物分離法厭氧菌的分離培養(yǎng)1．生物學方法：在培養(yǎng)基中加入動植物組織2．化學方法保險粉法：利用連二亞硫酸鈉（Sodiumhydrosulphite）和碳酸鈉以吸收空氣中的氧焦性沒食子酸法：焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收大量氧氣硫乙醇酸鈉法：硫乙醇酸鈉（HSCH2COONa）是一種還原劑，能除去氧或還原氧化型物質3．物理學方法：加熱、密封、抽氣等

含二氧化碳條件下細菌分離培養(yǎng)有些細菌特別是初次分離培養(yǎng)，要在含有5%～10％CO2。蠟燭缸法二氧化碳培養(yǎng)箱三、工業(yè)化大生產中細菌培養(yǎng)方法1、固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法：用于制備抗原、滅活苗苗或凍干苗苗2、液體靜置培養(yǎng)法：適于一般菌苗的生產3、液體深層通氣培養(yǎng)法：適于大量的培養(yǎng)，菌苗生產中的主要培養(yǎng)方法。反應缸4、透析培養(yǎng)法：培養(yǎng)物與培養(yǎng)基之間隔一層半透膜的培養(yǎng)方法。發(fā)酵器透析培養(yǎng)系統(tǒng)三、細菌計數技術總菌數計數法1．顯微鏡直接計數：利用血細胞計數器2．直接涂片計數法：數出紅細胞與菌數之比3．過濾計數法：測定空氣或水中的細菌數4．比濁計數法：麥氏比濁管活菌計數法：通常用菌落形成單位（CFU）表示1．傾注平板培養(yǎng)2．平板表面散布法3．微量點板計數法4、其他方法：玻璃片瓊脂薄層法、還原試驗法、大腸菌群最近似數測定法、過濾計數法等5、新技術方法：如生物發(fā)光法、放射測量法，鱟試驗法，電阻抗測量法等

第五節(jié)病毒增殖技術

一、病毒的增值病毒的增殖過程包括吸附、穿入、脫殼、病毒成分的合成、裝配與釋放等步驟。吸附吸附與溫度有一定關系，37℃時吸附最好要求病毒附加蛋白質細胞感受器穿入-----質膜溶解皰疹病毒,副粘病毒,艾滋病病毒HIV穿入----通過形成內涵體穿入----通過形成內涵體H+穿入-----有囊膜病毒fromSchaechteretal,MechanismsofMicrobialDisease,3rded,1998穿入-----無囊膜病毒

直接通過質膜H+穿入-----形成內涵體病毒成分的合成此過程稱為“隱蔽期”，主要為mRNA的轉錄、病毒多肽的轉譯和基因組的復制等根據病毒核酸及其轉錄和復制的方式不同，將動物病毒分為以下六個基本類型1．雙股DNA病毒2．單股DNA病毒3．雙股RNA病毒4．單股RNA（正股）病毒5．單股RNA（負股）病毒6．單股RNA（正股反轉錄）病毒病毒的裝配與釋放新合成的病毒蛋白質亞單位組成前衣殼，病毒核酸進入前衣殼而形成完整的病毒粒子。無囊膜的病毒由于細胞溶解而逸出胞外。有囊膜的病毒，在核膜、胞漿空泡膜和細胞膜上出芽時，獲得囊膜囊膜病毒出芽時，病毒糖蛋白進入細胞膜，使細胞獲得病毒抗原的特異性天花病毒的裝配與成熟SemlikiForestVirus釋放HIV釋放與成熟Hockleyetal.JGenVirol69:2455-2469沒感染的HIV感染的(athighermagnification)HIV感染的

二、病毒的營養(yǎng)需求必須利用活的細胞為其提供生物合成所需的能量和材料。常以動物、雞胚、細胞培養(yǎng)方法增殖病毒培養(yǎng)細胞的營養(yǎng)液主要成分包括：無機鹽離子、碳水化合物、氨基酸、維生素、蛋白質及抗生素等。三、禽胚增殖病毒技術禽胚的選擇接種途徑與收獲

絨毛尿囊膜接種法

尿囊腔接種法

羊膜腔接種法

卵黃囊接種法其它接種方法：腦內接種、胚體接種、靜脈接種10-11天齡雞胚影響禽胚增殖病毒的因素種蛋質量

SPF胚、母源抗體、抗生素殘留孵化技術

溫度、濕度、通風、翻蛋等接種技術：

無菌操作、傷及胚體雞胚接種后的檢查與收獲病毒棄去接種24小時內死亡的胚蛋，24小時后死亡的胚蛋隨時取出，放4～8℃冷凍4～24小時，以備收獲材料。收獲含病毒的尿囊液、羊水、絨毛尿囊膜、卵黃囊、胚體

四、培養(yǎng)病毒的細胞類型及其培養(yǎng)方法細胞類型1、原代細胞(2-3代)2、二倍體細胞株(有限性，10-50代)3、傳代細胞

(惡性轉化細胞系、轉化細胞系)細胞培養(yǎng)方法1、靜置培養(yǎng)2、轉動培養(yǎng)3、懸浮培養(yǎng)4、微載體培養(yǎng)5、中空纖維細胞培養(yǎng)6、微囊化細胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)細胞上皮細胞上皮樣細胞纖維原細胞上皮細胞------腺病毒正常感染初期感染后期上皮細胞(epithelialcells)–呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)感染前感染后纖維原細胞-------單純皰疹病毒正常感染初期感染后期纖維原細胞-----脊髓灰質炎病毒正常感染初期感染后期

三、實驗室細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞用器材及其處理一次性的使用方便酸堿處理、清潔、干燥、消毒細胞培養(yǎng)液和貯存液1、平衡鹽溶液(BSS)和磷酸緩沖鹽溶液(PBS)2、胰蛋白酶-EDTA溶液3．碳酸氫鈉溶液4．胰蛋白酶溶液5．水解乳蛋白溶液6．胰蛋白胨磷酸鹽肉湯（TPB）7．Eagle’s營養(yǎng)液8．199營養(yǎng)液9.RPMI－1640營養(yǎng)液10.犢牛血清、抗生素

細胞培養(yǎng)的細胞制備1、雞胚成纖維細胞(CEF)10天齡雞胚→去頭、腳、翅、內臟→剪碎→洗3次→加胰酶水浴消化→洗3次→加入生長液過濾→離心→加犢牛血清、營養(yǎng)液分裝培養(yǎng)瓶→24~48小時后成間層細胞

2．傳代細胞的培養(yǎng)：次代細胞和傳代細胞系的培養(yǎng)方法基本相同。良好單層的細胞→用無鈣鎂的磷酸平衡鹽水洗兩次→胰酶消化→加生長液分裝(1：3~4)細胞的保存單層的細胞培養(yǎng)→更換新的營養(yǎng)液→胰酶消化→收集細胞→細胞冷凍保護液→分裝干lml安瓿→0.05％美藍溶液中，4℃30min→一50～一70℃→液氮罐內貯存數年細胞的復蘇：將安瓿自液氮罐取出后立即放入37～40℃溫水中，在lmin之內使細胞融化→吸出細胞懸液→加入新的生長液，稀釋分裝培養(yǎng)瓶→貼壁后換液一次→至形成細胞單層。細胞的運輸：留少量生長液能覆蓋單層，防細胞干燥，防液體振蕩沖脫細胞。病毒的接種與檢查單層細胞培養(yǎng)→棄生長液→洗一次細胞面→接種待檢病料或病毒液→吸附30～60min→棄接種液加入維持液→細胞病變→鑒定病毒的蝕（空）斑技術病毒接種于細胞上→覆蓋一層瓊脂→形成局限性病灶→蝕斑多用于病毒克隆化及病毒含量的滴定細胞培養(yǎng)污染問題細菌污染真菌污染支原體污染病毒污染來源血清的原蟲污染五、以動物體增值病毒的技術

用途病毒的致病力、致病機理免疫應答方面制造疫苗抗血清等接種技術腦內接種法皮內接種法皮下接種法靜脈接種法腹腔接種法六、工業(yè)化大規(guī)模生產病毒的方法

1．多表面細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(多層玻璃板)2．微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)3．氣升懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)4．過濾培養(yǎng)5．大規(guī)模生產過程中的計算機自動控制系統(tǒng)第二章第六節(jié)

滅活劑、保護劑與免疫佐劑一、滅活劑滅活滅活—指破壞微生物的生物活性、繁殖能力和致病性，但不影響其免疫原性。微生物滅活、血清滅活、毒素滅活…滅活的主要方法物理滅活：加熱超聲波裂解、

60Co照射等化學滅活：用于滅活微生物的化學試劑或藥物稱為滅活劑。

甲醛、戊二醛烷化劑(乙?；蚁﹣啺贰⒍蚁﹣啺?、縮水甘油醛)、苯酚、結晶紫、

β-丙酰內酯影響滅活作用的因素滅活劑的特異性微生物種類與特性滅活劑濃度滅活溫度滅活時間酸堿度有機物的存在新型滅活劑的作用新型病毒滅活劑----辛酸鈉，用于血清制品的病毒滅活殼聚糖----可作為流感病毒滅活疫苗的新型佐劑二、保護劑指一類能防止生物活性物質在冷凍真空干燥時受到破壞的物質。作用機制：防止失去結合水阻止結合水形成結晶降低膜內外滲透壓差提供復蘇和修復所需的營養(yǎng)保護劑(穩(wěn)定劑)的種類1.滲透劑(二甲基亞砜、甘油和蔗糖等)，能滲入生物活性物質內部，降低因冷凍而增加的滲透壓，防細胞內脫水。

2.非滲透劑(聚乙烯吡咯烷酮“PVP”和蛋白質等)，能防止活性物質由外向內滲漏溶質。三.凍干保護劑的組成營養(yǎng)液：脫脂乳、蛋白胨、氨基酸、和糖類等賦形劑：蔗糖、山梨醇、乳糖、PVP、葡聚糖等抗氧化劑：Vit.C、Vit.E和硫代硫酸鈉等四、影響保護劑效能的因素保護劑的種類保護劑組分濃度保護劑配制方法保護劑酸堿度五、常用的凍干保護劑脫脂牛奶(TACC配方)脫脂奶-谷氨酸鈉(日本配方)7.5%葡萄糖-血清(NCYC配方)環(huán)乙醇-血清噴霧干燥穩(wěn)定劑(NCTC和NCIB的配方)……三、免疫佐劑佐劑（Adjuvant）或“免疫佐劑”凡能非特異地通過物理或化學的方式與抗原結合而增強其特異免疫性的物質。用于疾病預防、治療、免疫制備中1925年法國免疫學家Ranmon發(fā)現(xiàn)在疫苗中加入某些與之無關的物質可以特異性地增強機體的免疫反應佐劑的作用機理對抗原的作用增加抗原的表面積和改變活性基團構型增強T細胞和B細胞的協(xié)同作用使抗原緩慢降解和緩釋對機體的作用引起細胞浸潤，增強細胞免疫反應加速淋巴細胞的轉化為效應細胞使膜和胞漿活性增加分泌輔助因子細胞功能改變，免疫細胞數量增加完美佐劑的標準無致癌性;無毒性;純度高;有一定的吸附力;在動物體內能被降解、吸收;不含與動物有交叉反應的抗原物質;不誘發(fā)自身過敏反應;穩(wěn)定,儲存1年以上不分解、不變質佐劑的類型1、顆粒性佐劑鹽類佐劑油水乳劑佐劑蜂膠佐劑脂質體佐劑免疫剌激復合物(ISCOM)佐劑其它：MF59佐劑、微囊化佐劑、硬脂酰酪氨酸佐劑、γ-菊粉等佐劑的類型2、可溶性佐劑肽類：MDP表面活性分子類：TDM核酸及其衍生物類：CpGDNA,CpG-ODN含硫復合物類：左旋咪唑碳水化合物高分子類：多糖和DEAE-葡聚糖等細胞因子類：IL-γ-IFN脂質分體類：脂多糖，Vit.A\E其他：蛋白毒素如CT、PT、TT常用佐劑1、鋁鹽類佐劑

氫氧化鋁膠明礬磷酸三鈣氫氧化鋁成本低廉,使用方便、無毒,是胞外繁殖的細菌及寄生蟲抗原的良好免疫佐劑。主要的不足之處是鋁鹽佐劑僅能誘導、激發(fā)體液免疫。油乳劑佐劑弗氏佐劑、265佐劑、白油Span佐劑、MF259……

常用礦物油佐劑的缺點①礦物油在組織中因不能代謝而長期存在，造成局部組織損傷；②有污染致癌性多環(huán)芳香烴化物的危險，限制了礦物油佐劑只應用于實驗動物及一些獸用疫苗。

蜂膠（Propolis）佐劑蜂膠是蜜蜂采自柳樹、楊樹、栗樹和其它植物幼芽分泌的樹脂，并混入蜜蜂上顎腺分泌物，以及蜂蠟、花粉及其它一些有機與無機物的一種天然物質。蜂膠免疫性劑具有良好的免疫增強作用，它能增強巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體的產生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。質量不穩(wěn)定蜂膠需95%乙醇溶解蜂膠佐劑注射部位形成腫塊新型免疫佐劑細胞因子類佐劑CpGDNA(胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸DNA)基因工程減毒素免疫刺激復合物（ISCOM）佐劑脂質體(liposomes)佐劑MF59佐劑……新型佐劑----細胞因子類佐劑作為免疫佐劑，其佐劑活性不如常規(guī)佐劑作為免疫治療劑，預防治療某些病原感染通過基因重組，構建新型基因工程疫苗這類細胞因子主要為IL-2、IL-1、IL-12、γ-干擾素。CpGDNA(胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸)激活NK細胞和巨噬細胞刺激B細胞及產生Ig誘導分泌多種細胞因子誘導抗抗體誘生的細胞凋亡安全、無副作用、可人工合成(CpG-ODN—寡聚脫氧核苷酸)基因工程減毒素細菌細胞壁成分或毒素通過現(xiàn)代基因工程技術脫毒霍亂毒素(CT)大腸桿菌不耐熱毒素(LT)破傷風類毒素(TT)其他新型佐劑1、免疫刺激復合物（ISCOM）佐劑ISCOM是由抗原+QuilA+膽固醇=1：1：1混合后自發(fā)共價結合而成的一種較高免疫活性的脂質小泡。ISCOM現(xiàn)已廣泛應用于獸醫(yī)多種細菌、病毒和寄生蟲病的疫苗。ISCOM快速、有效地將抗原遞呈給免疫系統(tǒng)免疫后迅速激活機體的細胞免疫應答和體液免疫應答經口服或鼻腔接種獲得免疫,且能達到在局部和全身黏膜表面誘導有效而特異的黏膜應答;重復低劑量口服ISCOM疫苗不會引起免疫耐受只有含疏水基團很多的抗原或免疫原才能與ISCOM形成復合物2、脂質體(liposomes)佐劑人工合成的具有單層或單位膜樣結構的脂質小囊，由一個或多個類似細胞單位的類脂雙分子包囊水相介質所組成，具有佐劑兼載體效應。一類以提高抗原輸送和遞呈為主要作用的佐劑與弗氏佐劑或鋁膠合用，效果更佳脂質體膜對細胞膜具有很好的親和性,容易將包被在脂質體上或內部的抗原成分輸入到細胞內近似于病毒與宿主細胞的作用過程，定向傳輸主要存在問題是穩(wěn)定性由N’,Ｎ’-二甲基乙二胺基氨甲?；懝檀?DCchol)制備成的正電荷脂質體作為基因轉移的載體而被批準用于基因治療的臨床研究脂質體佐劑多在粘膜疫苗和基因工程疫苗上應用3、納米(Nanometer,NM)佐劑是將抗原物質或能編碼免疫原多肽的DNA或RNA包裹于納米粒子內部或是吸附在納米粒子表面,或與納米粒子結合納米乳劑是對黏膜無毒性的佐劑避免傳統(tǒng)疫苗的載體效應發(fā)生,提高生物利用度,提高制劑的均勻性、分散性和吸收性4、MF59佐劑4.3%角鯊烷+0.5%吐溫-80+0.5%司班-80制成水包油型疫苗可刺激體液免疫，可激發(fā)細胞免疫取代氟氏佐劑。采用了可代謝和無毒的鯊烯作為油劑,以減輕炎癥反應實驗效果并不穩(wěn)定5、QuilA佐劑QuilA系從南美皂樹樹皮中篩選到的具有佐劑活性的成分。使外源性抗原刺激機體Th1免疫應答,又能誘導CTL應答亞單位疫苗、細胞內病原體疫苗及癌癥疫苗的理想佐劑引起溶血、局部組織壞死,甚至全身不良反應或中毒6、胞壁酰二肽(MDP)及其衍生物佐劑從分枝桿菌細胞壁中分離到的具有活的最小結構片段誘導機體產生細胞因子存在致熱原性,在動物體內會引起賴特爾過敏綜合征注射局部反應輕微,極少化膿無抗原性和過敏原性,可反復注射無致癌作用分子量小,對生物學降解作用有抵抗力,可以口服。（七）佐劑的應用關鍵控制抗原-佐劑復合物的體積利用佐劑的靶向性優(yōu)化佐劑的選擇注重佐劑的聯(lián)合應用（八）在DNA疫苗上使用較有潛力的免疫佐劑CpG-ODN脂質體霍亂毒素(CT)大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)細胞因子…….（九）新佐劑的研發(fā)藥效、藥理、毒理學研究佐劑類型、聯(lián)用配方有效性、安全性、選擇性、可控性有機結合（十）中藥免疫佐劑具有多效性、雙向調節(jié)性、不良反應少、毒副作用小和無依賴性等特點。存在成分復雜、作用機制不清、穩(wěn)定性差多糖、黃酮、皂苷等是主要的活性成分能有效提高機體免疫力的中藥

滋補類藥物中的人參、枸杞、五味子、何首烏、黃芪、仙茅、肉桂等;清熱解毒藥物中的金銀花、仙人掌、黃連、黃芩、柴胡、穿心蓮、大黃、板藍根等;活血化瘀藥物中的紅花、三七、川芎及一些地衣類植物等方劑有:玉屏風散、補中益氣湯、小柴胡湯、養(yǎng)真方、銀翹散、白虎湯等中藥佐劑的作用機制免疫調節(jié)(細胞因子網絡的修飾)、抗原遞呈(抗原構象的維持)、細胞毒性T細胞(CTL)誘導、抗原靶向和儲存等中藥佐劑的研究方向傳統(tǒng)中藥制劑為研究對象以中藥有效部位(群)為研究對象以中藥有效單體為研究對象第六節(jié)

生物制品的冷凍真空干燥技術一、冷凍真空干燥(凍干)原理與特點原理：

將生物活性物質先行降溫凍結成固體，再在真空和適度加溫(不超過40℃)條件下使固體水分子直接升華成水汽抽出，最后使生物活性物質形成疏松、多孔樣固狀體。一、冷凍真空干燥(凍干)原理與特點特點：

(1)保護熱敏物質的活泩

(2)保護活性物質的性狀

(3)保持活性物質體積不變