分子標(biāo)記在植物遺傳改良中的應(yīng)用

SSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳改良中的應(yīng)用植物遺傳改良新技術(shù)進(jìn)展（三）報(bào)告人：楊合玉小組成員：辜菲、孫鑫俐、吳汝念專(zhuān)業(yè)：生物工程云南省生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1分子標(biāo)記技術(shù)1

SSR分子標(biāo)記2SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用3總結(jié)41.分子標(biāo)記技術(shù)遺傳標(biāo)記經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)標(biāo)記,細(xì)胞學(xué)標(biāo)記,生化標(biāo)記和分子標(biāo)記等4個(gè)階段。分子標(biāo)記是較為理想的遺傳標(biāo)記。它是在DNA水平上顯示性狀的遺傳差異，不受環(huán)境條件影響，具有分析手段快速簡(jiǎn)便，結(jié)論可靠等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位與篩選、標(biāo)記輔助育種及遺傳多樣性分析等各方面研究。目前分子標(biāo)記技術(shù)已有幾十種。依據(jù)多態(tài)性檢測(cè)手段可將分子標(biāo)記分為3大類(lèi)：基于傳統(tǒng)Southern雜交技術(shù)的如RFLP；基于PCR反應(yīng)的如RAPD、DAF、AFLP；以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的SSR、TRS等。2SSR分子標(biāo)記技術(shù)2.1SSR分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)介SSR(SimpleSequenceRepeat)又稱(chēng)微衛(wèi)星DNA(Microsatellite)，是一種由1-6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成，長(zhǎng)度一般100-200bp，

它廣泛分布于整個(gè)真核生物基因組的不同座位上，每個(gè)座位重復(fù)單位的數(shù)量可能不完全相同，從而形成多態(tài)性。又因其兩端多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR將其擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳分析技術(shù)獲得其長(zhǎng)度多態(tài)性，即SSR分子標(biāo)記。2.2SSR技術(shù)的特點(diǎn)相比之下SSR標(biāo)記技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組，揭示的多態(tài)性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)共顯性遺傳，不易被自然選擇和人工選擇所淘汰，符合孟德?tīng)栠z傳定律；(4)易于利用PCR技術(shù)分析，對(duì)DNA質(zhì)量要求低，用量少，不需使用同位素，即使是部分降解的樣品也可進(jìn)行分析；(5)每個(gè)位點(diǎn)由設(shè)計(jì)的引物順序決定，便于不同的實(shí)驗(yàn)室相互交流合作開(kāi)發(fā)引物。3SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用3.1在遺傳多樣性中的應(yīng)用利用SSR標(biāo)記的高多態(tài)性，結(jié)合相關(guān)分析、聚類(lèi)分析等數(shù)量遺傳分析手段，可以對(duì)不同親緣物種進(jìn)行分類(lèi)，判斷其親緣關(guān)系，評(píng)價(jià)不同品種的異質(zhì)性，并進(jìn)而劃分雜交優(yōu)勢(shì)群。在小麥遺傳多樣性變化動(dòng)態(tài)研究中，Wang等（2007）利用206對(duì)SSR引物檢測(cè)中國(guó)西部三省小麥的遺傳多樣性，通過(guò)遺傳距離以及聚類(lèi)分析顯示發(fā)現(xiàn)云南與西藏小麥品種親緣關(guān)系比云南與新疆以及西藏與新疆的都要近。中棉所陳光和杜雄明(2006)人利用SSR分子標(biāo)記對(duì)20世紀(jì)50年代我國(guó)引入海島棉以來(lái)培育的45個(gè)國(guó)內(nèi)品種(系)及8個(gè)國(guó)外品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果53個(gè)品種被分為兩大類(lèi)，與系譜來(lái)源一致。3.2在基因定位及分子輔助標(biāo)記中的應(yīng)用3.2.1基因定位SSR技術(shù)是尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記為遺傳育種早期選擇提供不受環(huán)境影響的遺傳標(biāo)記。同時(shí)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精確的定位，也是進(jìn)一步分離、克隆和導(dǎo)入目標(biāo)基因的前提。唐媛等(2008)以感白粉病小麥品種中國(guó)春與101-3雜交后代F2為材料，用65對(duì)6B染色體上和9對(duì)6A染色體上小麥微衛(wèi)星引物，進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)小麥微衛(wèi)星標(biāo)記Xgwm570與PmX

有(9.72±2.40)cM的遺傳距離，該結(jié)果表明，PmX

位于小麥染色體6BL上。3.2.2分子輔助標(biāo)記分子輔助標(biāo)記通過(guò)分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來(lái)判斷目標(biāo)基因是否存在。由于SSR分子標(biāo)記的共顯性標(biāo)記，正適用于功能基因的定位研究，便于在育種中對(duì)有關(guān)的功能基因的遺傳動(dòng)態(tài)進(jìn)行跟蹤，如目標(biāo)基因與某個(gè)分子標(biāo)記緊密連鎖，則通過(guò)對(duì)分子標(biāo)記基因型的檢測(cè)，就能獲知目標(biāo)基因的基因型。分子標(biāo)記輔助較傳統(tǒng)的育種方式有育種周期短、不受外界條件干擾等優(yōu)點(diǎn)。Zhang等(2009)在研究水稻開(kāi)花期QTLs與耐熱性的遺傳效應(yīng)關(guān)系時(shí)，利用單標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，SSR標(biāo)記染色體4號(hào)上的RM3735位點(diǎn)以及染色體3號(hào)上的RM3586位點(diǎn)與耐熱性有明顯的關(guān)系，尤其是RM3735位點(diǎn)可用于水稻耐熱性方面的分子輔助育種研究。3.3在遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用隨著分子標(biāo)記的迅速發(fā)展，促進(jìn)了遺傳圖譜構(gòu)建，SSR分子標(biāo)記是以SSR具有共顯性、多態(tài)率高且位點(diǎn)穩(wěn)定為基礎(chǔ)，在基因組中每隔一定距離找一個(gè)多態(tài)性的SSR標(biāo)記，當(dāng)這些標(biāo)記達(dá)到足夠的飽和度后則可利用SSR標(biāo)記找到基因組中的任何功能基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitativetraitloci,QTL)，并進(jìn)行連鎖整合和分析，確定該功能基因或QTLs

的位置。陳慶全和張玉光(2009)利用兩個(gè)優(yōu)良的秈型水稻恢復(fù)系T219和T226衍生的202個(gè)重組自交系(RILs)作為作圖群體，構(gòu)建了水稻全基因組連鎖圖譜。圖譜共包括181個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)分子標(biāo)記，圖譜總長(zhǎng)1559.6cm。該圖譜與多數(shù)已經(jīng)發(fā)表的圖譜相比具有較好的一致性。3.4在品種和純度鑒定中的應(yīng)用3.4.1品種鑒定近些年來(lái)，由于骨干自交系的頻繁使用，導(dǎo)致品種間的遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄，用傳統(tǒng)鑒定方法難以判別品種和親本自交系之間的親子關(guān)系，用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，便可解決這一難題。SSR能直接反映個(gè)體間DNA水平上的差異，具有高度的專(zhuān)一性和特異性。姚文華等(2009)利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)23份玉米自交系和4個(gè)測(cè)驗(yàn)種進(jìn)行雜優(yōu)類(lèi)群研究，從117對(duì)引物中篩選出77對(duì)擴(kuò)增帶譜清晰且具有多態(tài)性的SSR引物，在供試材料中檢測(cè)到398個(gè)等位基因變異，計(jì)算27個(gè)自交系間的遺傳距離(GD)在0.1074~0.4380，平均0.2880。GD大于0.3100的組合具有明顯產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)，GD小于0.2880組合的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)較弱。根據(jù)分子聚群并結(jié)合產(chǎn)量。和系譜來(lái)源分析，將27份自交系劃分為3個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群。3.4.2純度鑒定種子純度是評(píng)價(jià)種子質(zhì)量的主要指標(biāo)，種子純度的降低會(huì)明顯降低農(nóng)作物產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)。近年來(lái)，分子生物學(xué)的發(fā)展使品種純度檢驗(yàn)進(jìn)入到基因水平。品種間形態(tài)、生化及DNA分子標(biāo)記上的區(qū)別，歸根到底是品種間在基因序列及表達(dá)上的區(qū)別。分子鑒定是以品種DNA片段作為檢測(cè)對(duì)象，采用電泳方法檢測(cè)基因組DNA結(jié)構(gòu)與組成，通過(guò)分析DNA水平上的差異來(lái)檢驗(yàn)品種純度，有很高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，因而可以鑒定品種的真實(shí)性和純度。目前，以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記技術(shù)在此領(lǐng)域展示了廣闊的應(yīng)用前景。蔣益敏等(2009)以南校18號(hào)玉米雜交種及其親本自交系為材料，對(duì)胚芽和干種子的DNA進(jìn)行提取，對(duì)24對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，有3對(duì)特異性引物6mmc0241、umc2025、phi323152可用于南校18號(hào)雜交種和親本自交系的純度鑒定。黃成志等(2009)利用SSR分子標(biāo)記鑒定雜交水稻種子中優(yōu)88、協(xié)優(yōu)88和全豐優(yōu)88的真?zhèn)魏图兌?，并將鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)3個(gè)雜交種的SSR分子標(biāo)記鑒定和田間鑒定的結(jié)果基本上一致，沒(méi)有明顯的差異，說(shuō)明用SSR檢測(cè)雜交水稻種子純度是完全可行的。4總結(jié)SSR標(biāo)記技術(shù)以其豐富的多態(tài)性、共顯性遺傳、重復(fù)性好和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)植物的構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜、種質(zhì)資源評(píng)估、基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇、品種真實(shí)性和種子純度鑒定等領(lǐng)域的研究都有很好的應(yīng)用價(jià)值，并且它在人類(lèi)基因診斷和預(yù)測(cè)方面也有比較重要的作用。然而它一般需要建立篩選基因組文庫(kù)、克隆測(cè)序、引物設(shè)計(jì)等一系列實(shí)驗(yàn)，且SSR標(biāo)記中所使用的引物不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大。在進(jìn)行開(kāi)發(fā)應(yīng)用時(shí)，須首先克隆微衛(wèi)星位點(diǎn)，得到微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列以設(shè)計(jì)引物，初始開(kāi)發(fā)階段耗費(fèi)較大。此外，在遺傳圖譜的構(gòu)建中，